Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Summary

Dieser Artikel wird auf die Erzeugung von menschlichen Leber Entoderm aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen zu konzentrieren.

Abstract

Trotz der Fortschritte in der Modellierung menschlichen Medikamententoxizität scheitern viele Verbindungen in klinischen Studien wegen unvorhergesehener Nebenwirkungen. Die Kosten für klinische Studien sind erheblich, deshalb ist es wichtig, dass mehr prädiktiven Toxikologie Bildschirme entwickelt und frühzeitig in der Medikamentenentwicklung (Greenhough et al 2010) eingesetzt. Humane Hepatozyten stellen den aktuellen Gold-Standard-Modell für die Bewertung Medikamententoxizität, sondern sind eine begrenzte Ressource, die variable Funktion aufweisen. Daher sind die Verwendung von immortalisierten Zelllinien und tierischem Gewebe Modellen routinemäßig eingesetzt wegen ihrer Fülle. Während beide Quellen informative sind, werden sie durch eine schlechte Funktion, Arten Variabilität und / oder Instabilität in Kultur (Dalgetty et al 2009) begrenzt. Pluripotenten Stammzellen (PSCs) sind eine attraktive Alternative Quelle für humane Hepatozyten ähnlichen Zellen (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs sind in der Lage sich selbst erneuern und sich für alle somatischen Zelltypen des erwachsenen gefunden und stellen dabeieine potenziell unerschöpfliche Quelle von differenzierten Zellen. Wir haben ein Verfahren, das einfache, sehr effiziente, Automatisierung zugänglich und liefert funktionelle menschliche HLCs (; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 und Hay et al 2011 Hay et al 2008) entwickelt. Wir glauben, dass unsere Technologie, um das skalierbare Produktion von HLCs für die Wirkstoffforschung, Krankheit Modellierung, den Bau der extrakorporalen Geräten und möglicherweise zellbasierten Transplantation Therapien führen.

Protocol

1. Erste Vorbereitung aller chemischen Aktien und Beschichtung von Kultur Plastikwaren

Alle Schritte, die in einem Gewebekultur Motorhaube durchgeführt werden unter aseptischen Bedingungen.

1. Vorbereitung des menschlichen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (hbFGF)
   1. Bereiten Sie 10% BSA-Lösung in PBS und durch ein 0,22 um-Filter.
   2. Von den 10% BSA-Lösung vorzubereiten einer 0,2% igen BSA-Lösung.
   3. Fügen Sie 10 ml 0,2% BSA solution/100 pg hbFGF.
   4. Vornässen ein 0,22 um-Filter durch Filterung 5 mL 10% BSA-Lösung durch den Filter. Entsorgen Sie die 10 mL BSA waschen.
   5. Filtern Sie die hbFGF durch die pre-washed-Filter.
   6. Aliquot der hbFGF in sterile Eppendorfs und bei -20 ° C.
2. Vorbereitung der Menschenrechte Activin A-Stammlösung
   1. 1 ml 0,2% BSA in eine Spritze und vor nassen Filter.
   2. Verdünnen Sie die Activin A in 0,2% BSA in eine Aktiengesellschaft Konzentration von 100 ug / mL.
   3. Filtern Sie die Aktivitätenn Eine Lösung und Aliquots in sterile Eppendorfs, bei -20 ° C.
3. Vorbereitung der Maus Wnt3a Stammlösung
   1. Geben Sie 200 ul PBS auf eine 2 pg Fläschchen Wnt3a eine Aktie Konzentration von 10 ug / mL.
   2. Aliquot in sterile Eppendorfs und bei -20 ° C.
4. Vorbereitung der Menschenrechte HGF-Stammlösung (1000X)
   1. Verdünnen Sie die HGF in PBS, um eine Aktie Konzentration von 10 ug / mL.
   2. Filtern Sie die HGF-Lösung und Aliquots in sterile Eppendorfs, bei -20 ° C.
5. Vorbereitung der Oncostatin M Stammlösung (1000X)
   1. Verdünnen Sie die OSM in PBS, eine Aktie zu einer Konzentration von 20 pg / mL.
   2. Filtern Sie die OSM-Lösung und Aliquots in sterile Eppendorfs, bei -20 ° C.
6. Coating der Kultur Kunststoffprodukte mit Matrigel
   1. Auftauen 10 mL Lager Flasche Matrigel über Nacht bei 4 ° C auf Eis und fügen 10 mL der KO-DMEM. Gut mischen mit gekühltem Pipetten und Speicher 1mL Aliquots bei -20 ° C.
   2. Tauwetter ein Aliquot von Matrigel bei 4 ° C für mindestens 2 Stunden oder über Nacht auf die Bildung eines Gels zu vermeiden.
   3. 5 ml kaltem KO-DMEM auf die Matrigel, gut mischen mit einer Pipette.
   4. Machen Sie bis zu 15 mL mit kaltem KO-DMEM und mischen mit einer Pipette.
   5. Add Matrigel auf die Platte oder die Kolben beschichtet werden (Tabelle (i))

Plate / Flask	Volume / Well oder Flask
12-Well-Platte	0,5 ml pro Vertiefung
6-Well-Platte	1 mL pro Vertiefung
25cm 2-Kolben	2 ml pro Flasche

Tabelle 1. Empfohlene Mengen an Matrigel für die Beschichtung von typischen hochwertige Verbrauchsmaterialien für hESC Kultur.

6. 6. Inkubieren der beschichteten Platte oder Kolben über Nacht bei 4 ° C oder ein ZimmerTempature für 1 Stunde vor dem Gebrauch.
   7. Platten oder Flaschen, die mit Matrigel beschichtet wurden, können bei 4 ° C gelagert werden bis zu 1 Woche. Sie sollten deutlich mit dem Tag waren sie überzogen bezeichnet werden. Entsorgen Sie alle Platten oder Flaschen nicht innerhalb einer Woche verwendet.
      1. Vor dem Einsatz ermöglichen die beschichteten Kultur-Container zu kommen, um Raumtemperatur in einer Gewebekultur Kapuze.
      2. Unmittelbar vor der Verwendung absaugen Matrigel und fügen Sie die Zellsuspension auf die gut oder Kolben.

2. Regelmäßige Wartung der hESC Kulturen und Charakterisierung

1. Resuscitation von hES-Linien
   1. Entfernen hESCs von flüssigem Stickstoff Lagerung und schnell in einem 37 ° C Wasserbad auftauen.
   2. Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig in ein steriles Röhrchen mit mehreren ml warmes Medium.
   3. Pellet die Zellen durch Zentrifugation @ niedriger Drehzahl für 5min (1000 RPM).
   4. Absaugen des Überstandes und sehr sanft Reanimationpend die Zellen in warmen ES mittel-und Teller auf einem MEF Feeder-Schicht.
   5. Rückspeiseeinheiten Zellen täglich mit frischem ES-Medium und auf Subkonfluenz, die Zellen, benötigen die Zellen passagiert.
2. Routine hESC Wartung
   ES-Zellen werden in Platten oder Flaschen mit Matrigel beschichteten gewachsen. Die Zellen sind zu prüfen und fütterte täglich werden:
   1. Untersuchen Sie unter dem Mikroskop auf Kontamination, Zellmorphologie und Konfluenz.
   2. Saugen Sie das verbrauchte Medium.
   3. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von frischen embryonalen Maus-Fibroblasten-konditioniertem Medium (MEF-CM) + menschlichen bFGF (Endkonzentration 4 ng / mL) oder anderen serumfreien Medien ^6.
3. Die Passage Zellen mit Kollagenase
   hESC Linien (H1, H9 und RCM-1) erreicht Zusammenfluss alle 5-7 Tage nach der Passage bei einem 1:3-Split-Verhältnis. Frühe Passage hESCs in Gegenwart von Stromazellen wachsen langsamer und die Zeit auf dem Matrigel kann ein wichtiger Faktor geworden. Menschliche ES-Zellen sollten nicht länger als 14 bleibenTage auf dem gleichen Matrigel durch Matrixabbau und in diesem Fall kann es notwendig sein, um den Durchgang der Zellen bei einer 1:1 oder 1:2 Verhältnis, wenn die Zellen subkonfluenten sind.
   
   Enzyminkubation
   1. Alle Schritte, die in einem Gewebekultur Motorhaube durchgeführt werden unter aseptischen Bedingungen.
   2. Stellen Sie sicher, gibt es eine neue Matrigel beschichtete Schale oder Flasche nach Abschnitt 1.6 vorbereitet.
   3. Entscheiden Sie sich für den gewünschten Teilungsverhältnis für die Zellen. Eine Reihe von Faktoren sind bei der Entscheidung, das Split-Verhältnis beteiligt:
      1. Hohe Stroma mit geringen Anzahl von Kolonien: geht zurück auf eine kleinere Größe und passagiert werden oder passagiert 1:1, was loszuwerden einige Stroma wird und somit zur Erhöhung der Kolonie zu Stroma-Verhältnis, die Förderung hESC Wachstum.
      2. Hohe Stroma mit großen Kolonien, abhängig von der Anzahl der Kolonien kann 1:1 oder 1:2 passagiert werden, wenn genügend große hESC Kolonien sind.
      3. Typische wachsenden hESCs mit ein wenig stroma oder keine Stroma-und / oder eine Differenzierung kann 1:2 oder 3 passagiert werden.
      4. Saugen Sie das Medium aus dem Brunnen oder Kolben.
      5. Wash einmal mit 2 ml PBS (-MgCl _{2, CaCl-2).}
      6. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von Kollagenase (200 U / mL in KO-DMEM verdünnt) und bei 37 ° C für 2-5 min. Von 2 Minuten ab regelmäßig unter dem Mikroskop (1 Minuten-Takt). An der Stelle, die differenzierten Zellen beginnen zu heben und den Kolonien beginnen, am Rande der Zellen sind bereit, passagiert werden zu heben.
   Kratzen und Pooling der hESCs
   3. 6. Saugen Sie die Kollagenase.
      7. Wash einmal mit 2 ml PBS (-MgCl _{2, CaCl-2).}
      8. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von MEF-CM in Abhängigkeit von der Split-Verhältnis und mit einem Zellschaber physisch entfernen Sie die Zellen von der Oberfläche des Brunnens oder Kolben, dann verreiben genTLY durch Auf-und Abpipettieren 2-3 mal mit einer 10 ml Pipette. Es ist wichtig, dass die Zellkulturen in Klumpen von Zellen gehalten werden und sind nicht in einzelne Zellen gebrochen.
   Neuplattierungen die hESCs
   3. 9. Replate die resultierende Zellsuspension auf die neue Matrigel beschichteten Kolben oder Brunnen.
      10. Machen Sie das Volumen der MEF-CM bis zu 4 ml für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte.
      11. Beim Platzieren der Zellen in den Inkubator agitieren der Gewebekultur Behälter möglichst gleichmäßige Verteilung der Kolonien zu gewährleisten, als die Kolonien in der Mitte des Gewebekulturplatte / Kolben beeinflussen Zelle Neuplattierungen und Differenzierung Absetzen neigen.
4. Routine Charakterisierung von hES-Populationen mittels Durchflusszytometrie
   1. hESC Bevölkerung sind über Durchflusszytometrie einmal im Monat für die Stammzell-Marker wie 3. Oktober / 4, Tra 1-60 und SSEA-4 untersucht.
   2. hESCPopulationen sind von ihrem Substrat entfernt werden, da einzelne Zellsuspensionen nach einer 5 Minuten Behandlung mit Trypsin / EDTA (Invitrogen).
   3. Resuspendieren einzelnen Zellen bei 1x10 ⁶ Zellen / ml in PBS mit 0,1% BSA und 0,1% Natriumazid ergänzt.
   4. Inkubieren Zellpräparationen bei 4 ° C mit den entsprechenden Antikörpern für 40 Minuten.
   5. Wash Zellen zweimal mit PBS mit 0,1% BSA und 0,1% Natriumazid, um ungebundene Antikörper zu entfernen und zu resuspendieren, um ein Endvolumen von 100 ul und analysieren mittels Durchflusszytometrie ergänzt.
   6. Die Daten für 30000-40000 "live" Veranstaltungen sind für jede Probe mit einem FACS Caliber mit 488-nm-Laser ausgestattet erfasst und analysiert mit Hilfe CellQuest Software (Becton Dickinson, San Jose, CA). Ungefärbten Zellen werden als Kontrollen eingeschlossen. Tote und apoptotische Zellen zusammen mit Schutt wurden von der Analyse unter Verwendung eines elektronischen Live-Tor auf Vorwärtsstreuung und side scatter Parameter ausgeschlossen.

3. DifferentiATION von hESCs hepatische Entoderm

1. Erstellung von Medien zur Differenzierung von hES hepatische Endoderm. Alle Medien Vorbereitung sollte in einer Gewebekultur Motorhaube durchgeführt werden unter aseptischen Bedingungen.
   1. Vorbereitung von RPMI: B27 Grundierung Medium für Endoderm Differenzierung
      1. Für RPMI-B27 Medium Mix RPMI 1640 (500 mL) und B27 (50x, 10 mL)
      2. Swirl, um Komponenten zu vermischen.
      3. Fügen Sie alle Komponenten auf einem Filter und einem Filter unter Vakuum, lagern bei 4 ° C.
   2. Vorbereitung der SR-DMSO Medium für Hepatozyten Differenzierung
      1. Für SR-DMSO-Medium, mix 80% KO-DMEM, 20% KO-SR, 0,5% L-Glutamin, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1 mM β-Mercaptoethanol und 1% DMSO.
      2. Filtern Sie die Lösung unter vacum, lagern bei 4 ° C und aliquoten und bei -20 ° C, falls erforderlich.
      3. Verwenden Sie 4 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte und 6 ml pro T25-Kolben.
   3. Vorbereitung der L15 Reifung Medium für hepatocyte Reifung
      1. Für L-15-Medium, 500 ml Leibovitz L-15-Medium, Tryptosephosphat Brühe (Endkonzentration 8,3%), hitzeinaktiviertem Rinderserumalbumin (Endkonzentration 8,3%), 10 uM Hydrocortison 21-hemisuccinat, 1 uM Insulin (Rinderpankreas ), 1% L-Glutamin, 0,2% Ascorbinsäure.
      2. Filtern Sie die Lösung unter vacum, lagern bei 4 ° C und aliquoten und bei -20 ° C, falls erforderlich.
   4. Vorbereitung der endgültigen RPMI: B27 Grundierung Medium
      1. Dispense das erforderliche Volumen des Priming-Medium für das Experiment (1 mL pro Vertiefung einer 6-Well-Platte und 2 ml pro T25-Kolben).
      2. Add Activin A bis zu einer Endkonzentration von 100 ng / mL.
      3. Add rekombinanten Wnt3a bis zu einer Endkonzentration von 50 ng / mL.
      4. Gut mischen und in den Medien ist nun einsatzbereit.
      5. Diese endgültige Medien sollten täglich frisch hergestellt werden.
   5. Vorbereitung der abschließenden L-15 Reifungsmediums
      1. Dispense die erforderlicheVolumen von L-15-Medium für das Experiment (4 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte und 6 ml pro T25-Kolben).
      2. Add HGF zu einer Endkonzentration von 10 ng / mL.
      3. Add OSM zu einer Endkonzentration von 20 ng / mL.
      4. Gut mischen und in den Medien ist nun einsatzbereit.
      5. Diese endgültige Medien sollten täglich frisch hergestellt werden.
2. Priming hESCs um definitive Entoderm
   1. Kultur hESCs (H1, H9 und RCM-1) und propagieren auf Matrigel beschichteten Platten mit embryonalen Maus-Fibroblasten-MEF-CM mit bFGF ergänzt.
   2. Initiate hepatische Differenzierung, wenn hESCs einer Konfluenz Niveau von ca. 30% -60% (je nach hESC Linie) zu erreichen, indem die MEF-CM mit Grundierung (RPMI 1640-B27 ergänzt mit 100 ng / mL Activin A und 50 ng / mL Wnt3a.
   3. Die Zellen werden in Priming-Medium für 3 Tage (wobei das Medium alle 24 Stunden) kultiviert und endgültige Grundierung Medium mit Activin A und Wnt3a wird frisch zubereitet jeden Tag.
   4. Am Tag 8 Kultur der Zellen in der Reifung und Pflege mittel (L-15) mit 10 ng / mL hHGF und 20 ng / mL OSM für 9 Tage (wechselnde Medium alle 48 Stunden) ergänzt. Reifung und Pflege Medium mit hHGF und OSM wird täglich frisch hergestellt.
   5. Die Zellen allmählich weisen morphologische Veränderungen von einem stacheligen / Dreiecksform zu einer charakteristischen Lebermorphologie Anzeige einer polygonalen Aussehens (Abbildung 2A).
   6. Schematische für hepato-zellulären Differenzierung:

4. Charakterisierung von humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten hepatischen Entoderm

1. Immunfärbung
   1. Wash hESC abgeleitet HLCs mit PBS zweimal, je 1 Minute zu waschen.
   2. Fix die HLCs mit 4% PFA für 20 Minuten bei Raumtemperatur (die Zelles kann in PBS bei 4 ° C gelagert werden und gefärbt zu einem späteren Zeitpunkt). Die Zellen können auch mit eiskaltem Methanol für 10 Minuten bei -20 ° C fixiert werden
   3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, jeweils 5 Minuten waschen.
   4. Inkubieren Sie die Zellen für 2 Minuten bei Raumtemperatur mit 100% Ethanol für die Kernfärbung (dieser Schritt ist nicht erforderlich, wenn Methanol Fixierung verwendet wird).
   5. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, jeweils 5 Minuten waschen.
   6. Blockieren Sie die Zellen mit PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
   7. Entfernen Sie die Blocking-Puffer und fügen Sie die jeweiligen primären Antikörper in PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA und Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur verdünnt, oder über Nacht bei 4 ° C unter Rühren.
   8. Waschen Sie die Zellen 3 mal mit PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA bei Raumtemperatur, je 5 Minuten waschen.
   9. Fügen Sie die entsprechenden sekundären Alexa Fluor Antikörper (1:400) in PBS zu den Zellen und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde im Dunkeln unter Rühren verdünnt. Waschen Sie die Zellen 3 mal mit PBS, jeweils 5 Minuten waschen.
   10. Berg, jedes mit Mowiol 4-88 und DAPI (1:1000). Decken Sie die auch mit einem Deckglas, Pressen das Deckglas vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle Luftblasen entfernt sind und lagern bei 4 ° C im Dunkeln.
2. RNA-Isolierung und Extraktion
   1. Waschen Sie die hESC abgeleitet HLCs mit PBS und saugen.
   2. Fügen Sie 1 ml Trizol Reagenz und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
   3. Kratzen Sie die Zellen und in einem 1,5 ml Eppendorf (Lagerung bei -80 ° C für eine spätere Verwendung, wenn erforderlich).
   4. 0,5 ml Chloroform auf die eppendorf und mischen durch Invertieren; sicherstellen, dass diese in einem Abzug durchgeführt wird.
   5. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 13.000 RPM für 15 Minuten bei 4 ° C.
   6. Sammeln Sie die wässrige Schicht und in einen sauberen eppendorf, stellen Sie sicher, dass keine Kontamination aus der Schnittstelle.
   7. 1 ml Isopropanol und mischen durch Invertieren, bei Raumtemperatur lassen für 10 Minuten bis Niedertate der RNA.
   8. Zentrifuge bei 13.000 RPM für 10 Minuten bei 4 ° C.
   9. Saugen Sie den Überstand und stellen Sie sicher nicht auf die RNA-Pellet zu stören. Waschen mit 0,5 ml 70% Ethanol und lassen bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
   10. Zentrifuge bei 8.000 rpm für 5 Minuten bei 4 ° C.
   11. Saugen Sie das Ethanol und zu verlassen, um bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten trocknen lassen.
   12. Sobald das gesamte Ethanol verdampft ist, das Pellet in 30 ul deionisiertem Wasser. Bewahren Sie die RNA bei -80 ° C für eine spätere Verwendung.
   13. Quantifizierung der RNA-Konzentration mit einem Nano-Drop.
3. Reverse Transkription PCR
   1. Einrichten einer Reaktion mit zuvor isolierten RNA (200 ng), Random Hexamer, Nukleotide (10 mM) reverse Transkriptase und die jeweiligen Puffer in einem dünnwandigen 0,5 ml Eppendorf.
   2. Richten Sie eine negative RT, die obige Reaktion ohne die Reverse Transkriptase.
   3. Legen Sie die Rohre in einen Thermocycler, PCR-Maschine, und richten Sie die folgenden programm:
      1. 37 ° C - 5 Minuten (1 Zyklus)
      2. 42 ° C - 1 Stunde (1 Zyklus)
      3. 95 ° C - 5 Minuten (1 Zyklus)
   4. Bewahren Sie die cDNA bei -20 ° C für eine spätere Verwendung, falls erforderlich.
4. TAQMAN quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion Ernte der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten während der Differenzierung Protokoll. Extrahieren Sie die RNA und durchzuführen reverse Transkription qPCR mit den folgenden Primern und Assay on demand, (Applied Biosystems) Protokoll:
   1. 4. Oktober Hs03005111_g1
   2. Nanog Hs02387400_g1
   3. Albumin Hs00910225_m1
   4. Alpha-Fetoprotein Hs00173490_m1

Für die RNA-Isolierung und Extraktion bitte dem Kapitel 3.3.2 beziehen

1. Reverse Transkription und TaqMan qPCR
   1. Nehmen Sie 1 pg RNA und Reverse Transkription in cDNA mit Hilfe von Invitrogen Superscript III Reverse Transkriptionkit, nach den Anweisungen des Herstellers.
   2. 1 ul der cDNA in einem 25 ul TaqMan-Reaktion aus den entsprechenden Primer von Applied Biosystems, 18S ribosomalen Kontroll-Primer und Invitrogen 2x Platin qPCR Supermix UDG mit rox und eine entsprechende Menge Wasser verwendet.
   3. Gut mischen und Platz 10 ul von jeder Probe in zwei Vertiefungen entweder eine 96 oder 384-Well-Platte qPCR.
   4. Nachdem alle Proben belastet sind, sowie die entsprechenden Steuerelemente), Siegel der Platte und zu analysieren, auf dem Applied Biosystems 7900HT TAQMAN Maschine.
   5. Die Ergebnisse werden als relative Expression über ein Steuerelement Probe ausgedrückt.

5. Funktionelle Analyse von menschlichen embryonalen Stammzellen abgeleiteten hepatische Cytochrom-P450-Assays Endoderm - http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
   1. Inkubieren Tag 17 hESC leitete er mit dem spezifischen Substrat für 5 Stunden bei 37 ° C (n = 3). Verwenden Sie Gewebekultur-Medien alsNegativ-Kontrolle und bei 37 ° C für 5 Stunden.
   2. Sammeln Sie die Überstände und Durchführung der Tests gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   3. Messen Sie die relative Bedeutung der basalen Aktivität und zu normalisieren, die pro mg Protein als durch die BCA Assay (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101) bestimmt.

Hinweise

1. Alle Bände sind auf einer 6-well Platten-Format basiert. Passen Sie die Volumina entsprechend für die erforderliche Platte oder Kolben.
2. Alle Priming, Differenzierung und Reifung Medium wird unter Vakuum vor dem Gebrauch gefiltert.
3. Priming, Differenzierung und Reifung Medium bei 4 ° C nicht länger als 2 Wochen. Beurteilen Sie, wie viel Mittel für das Experiment und aliquoten die restlichen Medien und bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung ist nicht erforderlich.
4. Matrigel ist nach den Anweisungen des Herstellers aus; 1 mL Aliquots bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
5. Growth Faktoren einmal auf und machte aliquotiert bei -20 ° C gelagert werden und nach dem Auftauen bei 4 ° C gelagert werden nicht länger als 2 Wochen.
6. Der primäre Antikörper in der Regel verwendet, um hESC abgeleitet HLCs charakterisieren Albumin (1:250, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO).

5. Repräsentative Ergebnisse:

Charakterisierung von hES beibehalten werden, bevor die hepatische Differenzierung

Um die Stammzellen Status der H9 hESCs in der Studie verwendeten charakterisieren die wir untersucht haben eine Reihe von Parametern. Die Zellen zeigten hESC Morphologie, klein, dicht gepackten Zellen, die in definierten Kolonien (Abbildung 1A) und äußerte die pluripotente Stammzelle Genmarker, Oct-4.3 und Nanog (Abbildung 1B). Wir haben keine signifikanten Unterschiede in der Expression dieser Gene im Vergleich zu einer H7 hESC Linie positive Kontrolle. Darüber hinaus wurde 90,1% der Bevölkerung hESCs positiv für die Stammzell-Marker SSEA-4 (Abbildung 1C).

hESC Differenzierung zu hepatischen Entoderm

Menschliche embryonale Stammzellen können effizient zu Leber-Entoderm in vitro (Hay et al 2008) unterschieden werden. An Tag 9 der Differenzierung wurden die Zellen geerntet und die Differenzierung von hES zu HLCs bewertet wurde. Wie bereits berichtet die hESCs zeigten eine Reihe von tiefgreifenden morphologischen Veränderungen, und am Tag 9, ausgestellt frühen Hepatozyten Morphologie der Entwicklung eines polygonalen Aussehens (Abbildung 2A). Darüber hinaus wurde Herunterregulierung von Oct-3 / 4 über die 9 Tage Zeitverlauf beobachtet werden (Abbildung 2B). Im Gegensatz dazu waren Leber Transkripte AFP und Albumin hochreguliert (Abbildung 2C) von Tag 7 an.

In-vitro-Reifung von Leber Endoderm

Hepatische Entoderm wurde in vitro gereift mit den etablierten Verfahren (Hay et al 2008). Am letzten Tag der Differenzierung Kulturen wurden für die menschliche Leber Marker Albumin, AFP und E-Cadherin immungefärbt. Die Ausbeute an HLCs mit unseren Verfahren ist in der Regel 90% (Hay et al 2008; Hanoun et al 2010; Payne et al 2011). HLCs gefärbt Albumin, Alpha-Fetoprotein und E-Cadherin (Abb. 3) positiv.

Abbildung 1. Charakterisierung von Zellkulturen in dieser Studie verwendet. (A) Phasenkontrast-Mikroskopie-Aufnahmen Vertreter hESC Morphologie beobachtet in Kultur mit 4x und 10x Vergrößerung. Die Bilder wurden mit einer digitalen Nikon TE3000 / U inverse Mikroskop (B) hESCs kultiviert werden Octamer (Oct-4.3) positive und Nanog positiv. H7 hESCs wurden als Kontrolle für Pluripotenz Genexpression. Relative Ausdruck bezieht sich auf Falten der Induktion im Vergleich mit dem endogenen Gen-Steuerung, β-2-Mikroglobulin. (C) FACS Plots zeigen hESC Oberflächenmarker Ausdruck Ebenen, einschließlich der Bühne spezifische embryonale Antigene SSEA 4.

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Abbildung 2. (A) Phasenkontrast-Mikroskopie repräsentative Bilder von hES-derived Leber Entoderm Morphologie am Tag 9 der Differenzierung in Kultur beobachtet, bei x4 und x10 Vergrößerung. (B) Charakterisierung von Veränderungen in der Genexpression. RNA wurde extrahiert und die cDNA wurde analysiert durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion, die fortschreitende Herunterregulation von undifferenzierten Zellen Genexpression (Oct-4.3) und (C) Hochregulation von Hepatozyten Genexpression (Albumin und α-Fetoprotein). Relative Ausdruck bezieht sich auf Falten der Induktion im Vergleich mit dem endogenen Gen-Steuerung, β-2-Mikroglobulin am Tag 0 der Differenzierung. P <0,05 bezeichnet wird * und P <0,001 *** ist von den Studenten t-Test im Vergleich zu hESCs am Tag 0 gemessen bezeichnet. Fehlerbalken stellen 1 Standardabweichung.

Abbildung 3. Characterisation von hES-derived Leber Entoderm
Immunzytochemie zeigt Expression von Hepatozyten Markern, Albumin, AFP und E-Cadherin in hESC (H9) abgeleitet Leber Endoderm. Negative Kontrollen wurden mit entsprechenden Immunglobulin G (IgG) und Vertretern Bilder angezeigt werden durchgeführt.

Abbildung 4. HESC (H9) abgeleitet HLCs zeigen Stoffwechselaktivität. Am Tag 17, H9 differenziert, um HLCs ausgestellt CYP3A Stoffwechselaktivität (n = 6).

Discussion

Wir haben eine einfache, homogene und reproduzierbare in vitro-Modell, um skalierbare Ebenen der menschlichen HLCs generieren entwickelt. Unser Modell wurde von einer Reihe von externen kooperierenden Laboratorien validiert. Wir routinemäßig charakterisieren Stammzellen abgeleitete HLCs mit unserem Haus in Tool-Box von Entwicklungs-Marker und der Leber spezifischen funktionellen Assays (die meisten davon sind im Handel erhältlich). Die kritischen Phasen in unserem Prozess sind: die Erhaltung von Stammzellen Pluripotenz, die Fähigkeit, Stammzell-Differenzierung zur endgültigen Entoderm leiten; die Spezifikation von homogenen Kulturen der Leber Entoderm und die Fähigkeit zur Ableitung von reifen Leber Entoderm ausstellenden breite Palette Funktion in vitro.

Eine Beschränkung auf den großflächigen Einsatz der Stammzellen abgeleitete HLC Technologie hat das kurzfristige differenzierte Funktion der reifen Leber Entoderm in Kultur (~ 4 Tage auf Matrigel) gewesen. Als solche haben wir ein Polymer abgeschirmtBibliothek für die bio-aktiven und neuartige zelluläre unterstützt. Dies hat zur Identifizierung eines neuen Unterstützung, die Leberfunktion hält für mindestens 15 Tage geführt. Die zukünftige Ausrichtung für diese Technologie sind zunächst die industrielle Anwendung in der Wirkstoffentwicklung (Hay et al 2011). Mittelfristige Gewinne Form dieser Technologie sind wahrscheinlich humanisierter extrakorporalen Leber unterstützen Geräte zur Überbrückung oder zur Behandlung von Patienten mit Lebererkrankungen werden. Langfristige Gewinne aus dieser Technologie konnte in zellbasierten Transplantation Therapie für Lebererkrankungen, aber die aktuellen Daten zeigt, dass diese Strategie erhebliche Anstrengungen erfordert, bevor es sicher in der Klinik (Payne et al 2011) verwendet werden.

Zusammenfassend ist die Bedeutung unserer In-vitro-Technologie die Möglichkeit, homogene und grenzenlose Kulturen high fidelity menschlichen HLCs für angewandte Biologie zu generieren.

Materials

Matrigel coating plates and flasks Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK) Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK) hESC Maintenance Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C. Passaging hESCs with collagenase Confluent well or flask of hESCs. Matrigel coated wells or flasks as appropriate. Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA). Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA). Differentiation of hESCs to hepatic endoderm RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. β-Mercapt–thanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C. F–tal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK) Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm Immunostaining Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK). Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature. Ethanol Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK). MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution. Primary antibodies Antigen* Type Supplier Dilution ALB Mouse Monoclonal Sigma Aldrich 1/500 E-Cadherin Mouse Monoclonal Millipore 1/100 α-fetoprotein Mouse Monoclonal Sigma 1/500 SSEA-4 FITC Mouse Monoclonal Biolegend 1/100 IgG Mouse Monoclonal DAKO 1/500 Secondary antibodies Anti-mouse FITC conjugate Goat Monoclonal Invitrogen 1/400 Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from. Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein) Cytochrome P450 Assays p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA). White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK). BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK). Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)