Un haut-débit, plate-forme automatisée de développement des cellules de fabrication pour produire des protéines thérapeutiques est décrite. La mise en œuvre de la BD FACS Aria trieur de cellules, CloneSelect Imager et TECAN Freedom EVO système de manipulation de liquides a démontré la capacité de traitement significativement augmenté dans le développement de la lignée cellulaire avec une qualité améliorée de lignée cellulaire et la reproductibilité élevée.
L'industrie biopharmaceutique en pleine croissance exige le développement rapide de systèmes de production hautement efficace et fiable pour répondre à l'exigence croissante de l'approvisionnement en médicaments. La génération de lignées cellulaires de production a traditionnellement impliqué des opérations manuelles qui sont main-d'œuvre, à faible débit et les plus vulnérables à des erreurs humaines. Nous rapportons ici une plateforme intégrée à haut débit et automatisé pour le développement de lignées de cellules de fabrication pour la production de protéines thérapeutiques.
La combinaison de la BD FACS Aria ™ trieur de cellules, CloneSelect ™ Imager et TECAN Freedom EVO ® système de manipulation de liquides a permis un processus cellulaire à haut débit et plus efficace ligne de développement. Dans cette opération, les cellules hôtes de production sont d'abord transfectées avec un vecteur d'expression portant le gène d'intérêt 1, suivi par le traitement avec un agent de sélection. Les cellules transfectées de façon stable sont ensuite colorés avec la fluorescence des anticorps anti-IgG humaines, et sont ensuite soumis à une analyse de cytométrie en flux 2-4. Cellules très productives sont choisis en fonction de l'intensité de fluorescence et sont isolés par une seule cellule de tri sur une BD ™ FACSAria. La formation de colonies de cellules mono-étape a été détecté au microscope et une série d'images numériques du temps tours sont prises par l'imageur CloneSelect ™ pour la documentation de l'histoire de la lignée cellulaire. Après des clones individuels ont formé, ces clones ont été testés pour la productivité par ELISA effectuée sur un EVO TECAN Freedom ® système de manipulation des liquides. Environ 2,000 – 10,000 clones peuvent être criblés par cycle de fonctionnement avec la configuration actuelle du système.
Cette approche intégrée a été utilisée pour générer de haute production de hamster chinois lignes cellules ovariennes (CHO) pour la production d'anticorps monoclonaux thérapeutiques (mAb) ainsi que de leurs protéines de fusion. Avec l'aide de différents types de sondes de détection, la méthode peut être utilisée pour développer des protéines thérapeutiques ou être appliqué à d'autres systèmes hôte de production. La comparaison avec la procédure manuelle traditionnelle, cette plate-forme automatisée démontré les avantages d'une capacité nettement accrue, clonalité assurée, de la traçabilité dans l'histoire de la lignée cellulaire avec documentation électronique et la possibilité très réduite dans l'erreur de l'opérateur.
Nous avons présenté une cellule automatisée de fabrication de développement plateforme en ligne qui permet l'isolement de clones très productifs, et en attendant, assure clonalité et la stabilité clone. L'engagement de la coloration des anticorps de surface suivie d'un tri cellulaire FACSAria ™ est la clé pour obtenir des clones individuels de productivité élevés d'anticorps. Nos résultats et d'autres rapports 2-4 suggèrent que le niveau d'anticorps transitoirement affichés sur la surface des cellules est bien corrélée avec la productivité de la cellule. Ainsi, un anticorps conjugué à la fluorescéine peut être utilisée pour reconnaître les produits associée à la membrane et l'aide de l'isolement des producteurs de haut. Alternativement, la coexpression de gènes rapporteurs et de la technologie micro-goutte de gel ont été utilisés pour faciliter la sélection de forte production de clones par FACS 6-8. En plus d'isoler haute clones produisant par FACS, d'autres technologies ont évolué pour atteindre le même objectif. Il s'agit notamment de la technologie Trellis CellSpot Bioscience qui utilise des systèmes de détection d'anticorps microspere et la technologie de dépistage au laser pour identifier des clones très productifs et éliminer les cellules indésirables, Genetix ClonePix FL et StemCell Technologies ClonaCell EasyPick plateforme qui effectuent criblage à haut débit de lignées cellulaires de production utilisant un système de détection d'anticorps fluorescents . Nous avons choisi de mettre en œuvre la méthode de clonage FACS basée sur le niveau d'anticorps de surface associées, car il combine la facilité d'utilisation, la sélectivité sur la productivité et la clonalité.
L'emploi de Tecan Freedom EVO ® système de manipulation des liquides considérablement augmenté le débit de dépistage, qui offrent la possibilité de sélectionner des clones à haut rendement à partir d'un pool de cellules beaucoup plus grandes. Autres instruments pour le dosage tels que HTRF, BioForte Octuor, HPLC, etc, sont tous les moyens possibles de sélection des producteurs de haut et de dépistage des producteurs bas. En suivant la formation de clone avec CloneSelect Imager ™, nous avons généré des documents nécessaires pour prouver la clonalité de l'histoire de lignée cellulaire numérisé. Clonalité est encore confirmé par génétiquement caractérisent seul site d'intégration du transgène sur le chromosome. Une étape sous-clonage, qui est habituellement prises pour assurer la clonalité, peuvent ainsi être éliminés. Cela permettra d'économiser 4-8 semaines de temps pour le développement de lignées cellulaires. En résumé, les lignées cellulaires de qualité générés par la plate-forme à haut débit automatisé a montré une productivité élevée, la stabilité de production et de l'histoire documentée lignée cellulaire qui devrait répondre à la demande à grande échelle de production et les exigences réglementaires actuelles.
The authors have nothing to disclose.
Name | Company |
BD FACS Aria™ Cell Sorter | BD Bioscience |
CloneSelect™ Imager | Genetix |
TECAN Freedom EVO® liquid handling system | Tecan Group |