Ein High-Throughput-, automatisierten Plattform zur Herstellung von Zelllinien-Entwicklung für die Herstellung von Protein-Therapeutika wird beschrieben. Implementierung von BD FACS Aria Cell Sorter hat CloneSelect Imager und Tecan Freedom EVO Liquid-Handling-System deutlich erhöht Verarbeitungskapazität in Zelllinien-Entwicklung mit verbesserten Zell-Linie Qualität und hohe Reproduzierbarkeit nachgewiesen.
Die schnell wachsenden biopharmazeutischen Industrie fordert rasche Entwicklung von hocheffizienten und zuverlässigen Produktionssysteme auf die zunehmende Forderung nach Medikamenten versorgt gerecht zu werden. Die Erzeugung von Produktions-Zelllinien ist traditionell manuellen Operationen, die arbeits-, Low-Durchsatz und anfällig für menschliche Fehler beteiligt sind. Wir berichten hier ein integriertes High-Throughput-und automatisierte Plattform für die Entwicklung der Herstellung von Zelllinien für die Herstellung von Protein-Therapeutika.
Die Kombination von BD FACS Aria ™ Cell Sorter, CloneSelect ™ Imager und Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System hat einen hohen Durchsatz und eine effizientere Entwicklung von Zelllinien Prozess aktiviert. In diesem Betrieb werden die Produktion Wirtszellen zuerst mit einem Expressionsvektor trägt das Gen von Interesse 1, durch die Behandlung mit einer Auswahl Agenten gefolgt transfiziert. Die stabil transfizierten Zellen werden dann mit Fluoreszenz-markierten Anti-Human-IgG-Antikörper gefärbt und sind anschließend im Rahmen Durchflusszytometrie 2-4. Hochproduktive Zellen werden auf der Grundlage Fluoreszenzintensität ausgewählt und werden von single-cell sorting auf einer BD FACSAria ™ isoliert. Colony Bildung von Einzel-Zell-Stadium wurde mikroskopisch erkannt und eine Reihe von Zeit-Runden digitalen Bilder werden von CloneSelect ™ Imager für die Dokumentation der Zelllinie Geschichte genommen. Nach einzelnen Klone gebildet haben, wurden diese Klone für die Produktivität durch ELISA auf einem Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling durchgeführt System gezeigt. Etwa 2.000 – 10.000 Klone können pro Arbeitstakt mit dem aktuellen System-Setup zu sehen sein.
Dieser integrierte Ansatz wurde genutzt, um hohe Produktion von chinesischen Hamsters (CHO)-Zelllinien für die Herstellung von therapeutischen monoklonalen Antikörper (mAb) sowie deren Fusionsproteine zu erzeugen. Mit Hilfe der verschiedenen Arten der Erfassung Sonden kann die Methode für die Entwicklung anderer Protein-Therapeutika eingesetzt werden oder in andere Produktions-Host-Systeme angewendet werden. Im Vergleich zu den herkömmlichen manuellen Verfahren zeigte diese automatisierte Plattform Vorteile von erheblich erhöhter Kapazität, gewährleistet Klonalität Rückverfolgbarkeit in Zelllinie Geschichte mit elektronischer Dokumentation und einer stark reduzierten Möglichkeit in Bedienfehler.
Wir präsentierten eine automatisierte Fertigung zur Entwicklung von Zelllinien-Plattform, die Isolierung von hoch produktiven Klonen ermöglicht, und in der Zwischenzeit, während sichergestellt, Klonalität und Klon Stabilität. Das Engagement der Oberfläche Antikörper-Färbung von FACSAria ™ cell sorting gefolgt ist der Schlüssel zum Erhalt einzelner Klone mit hohen Antikörper-Produktivität. Unsere Ergebnisse und weitere Berichte 2-4 zeigen, dass die Antikörper-Ebene vorübergehend auf der Zelloberfläche angezeigt und mit der Produktivität der Zelle korreliert. So kann ein Fluorescein-konjugierten Antikörper verwendet, um die Membran zugehörigen Produkt zu erkennen und Hilfe zur Isolierung von hoher Produzenten werden. Alternativ haben Koexpression von Reporter-Genen und Gel microdrop Technologie eingesetzt, um die Auswahl an High-produzierende Klone durch FACS 6-8 erleichtern. Zusätzlich zu isolieren hohe produzierende Klone via FACS, haben andere Technologien entwickelt, um das gleiche Ziel zu erreichen. Dazu gehören Trellis Bioscience CellSpot Technologie, microspere Antikörper-Detection-Systeme und Laser-Screening-Technologie nutzt, um hochproduktive Klone zu identifizieren und zu eliminieren unerwünschte Zellen, Genetix ClonePix FL und StemCell Technologies ClonaCell EasyPick Plattform, die das Hochdurchsatz-Screening der Produktion Zelllinien mit Hilfe eines Fluoreszenz-Antikörper-Nachweis-System durchführen . Wir entschieden uns für die FACS Klonen Methode an der Oberfläche verbunden Antikörperspiegel Basis implementieren, da es die Einfachheit der Bedienung, Selektivität auf die Produktivität und Klonalität verbindet.
Die Beschäftigung von Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System deutlich erhöht Screening-Durchsatz, der die Möglichkeit, sich für High-Yield-Klone aus einer viel größeren Zellpool wählen können. Andere Instrumente zur Analyse, wie HTRF, Bioforte Oktett, HPLC, etc, sind alle möglichen Mittel zur Auswahl Hochproduzenten und Screening niedrigen Produzenten. Durch die Verfolgung Klon Formation mit CloneSelect Imager ™ erwirtschafteten wir erforderlichen Unterlagen Klonalität mit digitalisierten Zelllinie Geschichte zu beweisen. Klonalität wird durch genetisch charakterisieren einzigen Transgen-Integration vor Ort auf dem Chromosom bestätigt. Eine Subklonierung Schritt, der in der Regel getroffen werden, um Klonalität zu gewährleisten, kann somit entfallen. Dies wird 4-8 Wochen Zeit für die Entwicklung von Zelllinien zu speichern. Zusammenfassend zeigten die Qualität Zelllinien durch die High-Throughput-automatisierte Plattform generiert eine hohe Produktivität, Produktion Stabilität und dokumentiert Zelllinie Geschichte, dass die Nachfrage für eine groß angelegte Produktion und aktuellen regulatorischen Anforderungen erfüllen sollte.
The authors have nothing to disclose.
Name | Company |
BD FACS Aria™ Cell Sorter | BD Bioscience |
CloneSelect™ Imager | Genetix |
TECAN Freedom EVO® liquid handling system | Tecan Group |