Summary
Vi visar tillverkning av en enkel mikroflödessystem enhet som kan integreras med standard elektrofysiologi uppställningar för att exponera mikroskala ytor av en hjärna skiva på ett väl kontrollerat sätt till olika signalsubstanser.
Abstract
Vi har visat tillverkning av en två-nivå mikroflödessystem enhet som enkelt kan integreras med befintliga elektrofysiologi inställningar. De två nivåer mikroflödessystem enheten är tillverkad med hjälp av en två-stegs-standarden negativa motstå litografi process 1. Den första nivån innehåller mikrokanaler med in-och utlopp i vardera änden. Den andra nivån innehåller mikroskala cirkulärt hål ligger mitt i kanalen längd och centrerad tillsammans med kanalbredd. Passiv pumpa metoden används för att pumpa vätskor från inloppet till utloppet 2. Den mikroflödessystem enheten är integrerad med off-the-shelf kamrarna perfusion och möjliggör sömlös integration med elektrofysiologi installationen. Vätskorna introducerades på inloppsportar flödet genom mikrokanaler mot utloppet hamnar och även fly genom den cirkulära öppningar placerade på toppen av mikrokanaler i badet av perfusion. Således bottenytan av hjärnan skiva placeras i perfusion kammaren badet och ovanför mikroflödessystem enheten kan utsättas med olika signalsubstanser. Den mikroskala tjocklek mikroflödessystem enheten och öppna karaktär av material [glas täckglas och PDMS (Polydimetylsiloxan)] används för att göra mikroflödessystem enhet möjliggör mikroskopering av hjärnan skiva. Den mikroflödessystem Enheten tillåter modulering (både rumsliga och tidsmässiga) av de kemiska stimuli presenterades för mikromiljöer hjärnan slice.
Protocol
SU-8 mögel tillverkning
Mästare förberedelse
- SU-8 sjökapten på kiselskiva substrat är beredd att använda en två-stegs-standarden negativa motstå litografi processen.
- Justeringen märken på kiselskiva avlägsnas med ett rakblad som höjden av dessa strukturer (som ligger längs den yttre periferin av skivan) är mer än den faktiska enheten strukturer.
- Den kiselskiva sedan rengöras med isopropylalkohol och torkas i en ström av N 2. Stöd pelare gjord av tejp med tjocklek mindre än den högsta enhetsstrukturen ersätta anpassning märken på fyra sidor av skivan.
Obs: Om stödet pelare höjd är mer än den högsta enheten strukturer är genom hål inte bildas i PDMS mögel. - Befälhavaren kiselskiva är placerad på en värmeplatta vid rumstemperatur.
PDMS beredning av lösningar
- Fyra gram Polydimetylsiloxan (PDMS) lösning bereds genom att noga blanda 10 delar av silikon elastomer med en del av härdare.
Obs: Se till att de två lösningarna blandas jämnt att få liknande fysiska egenskaper i hela PDMS mögel. - De bubblor som genereras i PDMS lösning under blandningsprocessen tas bort med hjälp av en vakuumexsickator.
PDMS beläggning och härdning
- Den bubbelfritt PDMS lösning är långsamt dispenseras på SU-8 mästare och se till att bubblor inte uppstår under dosering processen.
- Ena änden av en nedskrivning på OH-film placeras sedan på den varma plattan och sakta placeras på PDMS lösningen jämnt sprida PDMS på SU-8 master. Alla bubblor som genereras under den här processen måste tas bort med hjälp av en sond.
[OBS: Lyft inte den öppenhet för att undvika uppkomst av fler bubblor.] - En borofloat platta är placerad på toppen av öppenhet bladet att tillämpa enhetliga tryck. Man trycker lätt på ovansidan av de högsta cirkulära strukturer (ligger mitt i kanalen längder och centrerade längs bredd kanaler) så att det är liten eller ingen PDMS inklämt mellan öppenhet och SU-8 ytan av cirkulära strukturer.
- Ytterligare tre borofloat plattor placeras ovanpå kiselskiva-borofloat platta smörgås att tillämpa konstant tryck på ovansidan av rund öppning strukturer före och under härdningen.
- Temperaturen på den heta plåten sedan ökas till 75 ° C och PDMS är botad vid denna temperatur i 1 timme. Värmeplattan förs till en temperatur på 50 ° C.
- De plattor tas bort och insynen är försiktigt bort lämnar efter befälhavaren och den tunna PDMS plåt belagd ovanpå det.
Byggandet av mikroflödessystem enhet
Borttagning av PDMS plåt från master
- Den yttre gränsen av perfusionen kammaren är huggen ur på PDMS arket med hjälp av ett rakblad efter justering portarna på perfusionen kammaren med portarna på SU-8 master.
- Den PDMS blad är sedan försiktigt bort från befälhavaren, dra längs kanalerna för att förhindra att riva av PDMS. Den PDMS arket placeras på en öppenhet ark med mikroflödessystem nätverket ytan uppåt.
- In-och utlopp hamnarna görs sedan med hjälp av en kork borr.
Limning av PDMS plåt till glas täckglas
- Den bindning yta PDMS ark (ytan innehåller mikroflödessystem nätverket) och ett glas täckglas är sedan försiktigt rengöras med en 3M tejp, placerad på ett blad av öppenhet, och slutligen placeras i O 2 plasma kammare.
- Den bindning ytor är behandlade med 165 watt plasma för 10 s. I plasma behandlas glasytan täckglas omedelbart bundna till plasma-behandlad yta PDMS arket.
Observera: Applicera ett lätt tryck på glasytan för att avlägsna eventuella luftbubblor fastnar mellan bindning ytor. - Låt 5 minuter för att få god vidhäftning mellan PDMS och glas. Efter 5 minuter försiktigt bort den öppenhet som PDMS bladet var placerad för limning processen.
- Den mikroflödessystem enheten är placerad i syre plasma för att göra kanalerna hydrofila. Plasma behandling sker på 165 watt i 1 minut.
Integration av mikroflödessystem enheten och perfusion kammare
Beredning av perfusion kammaren
- En off-the-shelf perfusionen kammare beställdes, och in-och utlopp portar borrades så att när mikroflödessystem enheten och kammaren är bundna, är portarna på kammaren och enheten justeras. Den nedre ytan av perfusionen kammaren är belagd med PDMS för att få en tät tätning mellan kammaren och mikroflödessystem enhet.
- En nedskrivning om öppenhet ark placeras på en värmeplatta vid rumstemperatur.
- Ett gram PDMS bereds i en process som liknar den som beskrivits tidigare. Den bubbelfritt PDMS lösningen är sedan sakta dispenseras på öppenhet ark undvika bubblor.
- Den perfusionen kammaren placeras sedan på PDMS lösningen.
- En borofloat platta placeras sedan ovanpå kammaren att tillämpa enhetliga trycket och för att få en tunn beläggning av PDMS på undersidan av kammaren.
- Temperaturen på den heta plåten sedan ökas till 75 ° C och PDMS är botad vid denna temperatur i 1 timme.
Limning av mikroflödessystem enheten och perfusion kammare
- Plattan tas bort och öppenhet är försiktigt bort lämnar bakom perfusion kammaren och tunna PDMS plåt belagd på dess undersida. Oönskade PDMS är bort med ett rakblad och en vass spets sond för PDMS bort från tillgång portar.
- De PDMS yta mikroflödessystem enheten och PDMS bottenyta kammaren sedan försiktigt rengöras med en 3M tejp, placerad på ett blad av öppenhet, och slutligen placeras i syre plasma kammaren.
- Ytorna behandlas med 165 watt plasma för 10 s. De PDMS belagd yta kammaren omedelbart bundna till PDMS yta mikroflödessystem enhet.
Observera: Applicera ett lätt tryck på glasytan för att avlägsna eventuella luftbubblor fastnar mellan bindning ytor. - Omedelbart före användning, är enheten placeras i syre plasma för att göra kanalerna hydrofila. Plasma behandling sker på 165 watt i 1 minut.
Exponera hjärnan skivor till neurokemiska mikromiljö med mikroflödessystem enhet
- Den hydrofila mikrokanaler av (mikroflödessystem enhet) - (perfusion avdelningen) kombination är fyllda med standard ACSF (Konstgjort cerebrospinalvätska) lösning.
- Fördela små droppar av ACSF lösning vid inloppet hamnar och låt lösningen vara onda upp i kanalerna. Ta bort eventuella bubblor kvar med en spruta från utloppet. Fördela en stor droppe ACSF lösning vid utloppet för att möjliggöra passiv pumpning av vätskor från inloppet till utloppet hamnar i mikroflödessystem enhet.
Notera: Försiktighet bör vidtas för att ta bort alla bubblor från kanalerna för att flödet av vätskor med hjälp av passiva pumpa metoden. - Fäst (mikroflödessystem enhet) - (perfusion kammare) combo på slätten plattformen och fixa slätten plattformen i mikroskop adaptern.
- Anslut den vanliga in-och utlopp (sug) slangen till perfusion kammare för kontinuerlig perfusion av hjärnan skiva med standard ACSF lösning. Den ACSF Lösningen är kontinuerligt sugs med 95% O2-5% CO 2.
Obs: Justera positionen för sug slangen att hålla konstant nivå ACSF i badet av perfusion kammaren. - När perfusionen kammaren är fylld med ACSF lösning, placera en hjärna segment i perfusionen kammaren med hjälp av en pipett. Med hjälp av en sond, ställning hjärnan bit ovanför den cirkulära öppningar i mikroflödessystem enhet. När hjärnan skiva är på önskad position över cirkulära öppningar, använd en bit ankare för att immobilisera hjärnan slice.
- Den mikroflödessystem enheten kan nu användas för att utsätta hjärnan skivor (placeras i perfusion kammaren och på toppen av mikroflödessystem nätet) till olika signalsubstanser som använder passiva pumpning av vätskor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Befintliga makroskala eller mikroskala hjärnan skiva perfusion kamrar är begränsade när det gäller den rumsliga upplösningen de ger utsätta hjärnan skivor med signalsubstanser. Den mikroflödessystem enhet tekniken visat här övervinner denna begränsning med enkla bioMEMS tekniker. Det förväntas att enkelheten i tillverkningen av mikroflödessystem enheten och enkelt att integrera dem med befintliga elektrofysiologi uppställningar kommer att tillåta utbredd tillämpning av visat anordningen tekniken. Intressant experiment som inte var möjligt tidigare kan utföras med den aktuella mikroflödessystem enhet. Olika mikromiljöer i hjärnan skiva kan utsättas för olika signalsubstanser i olika tidsskalor. Den nuvarande prototyp enhet består av endast fyra parallella kanaler och cirkulära öppningar bredvid varandra. Dock kan denna enhet layouten enkelt ändras genom att införa olika mönster som skulle ha öppningar i olika former eller storlekar, eller mikrokanaler kunde slingrade på ett sätt som skulle leda till placeringen av öppningar i olika mikromiljöer i hjärnan skivor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna är öppna för samarbeten som omfattar visat mikroflödessystem teknik till olika områden av biologin.
Acknowledgments
Finansieringen kom från NIH MH-64.611 och NARSAD Young Investigator Award. Författarna vill också erkänna Adam Beagley, Mark Dikopf och Ben Smith för deras tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-26GPL | Tool | Warner Instruments | W2-64-0236 | Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber |
| SHD-26GH/10 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0253 | Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit |
| Plasma Preen-II 862 | Tool | Plasmatic Systems, Inc. | Microwave plasma system | |
| Model P-1 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0277 | Series 20 Plain Platform, Model P-1 |
| SA-NIK | Tool | Warner Instruments | W2-64-0291 | Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK |
| Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid) | Reagent | Exact composition will vary with application |
References
- Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment. Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).
- Walker, G. M., Beebe, D. J. A passive pumping method for microfluidic devices. Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).
