Summary
Мы показываем, изготовление простой микрожидкостных устройство, которое может быть интегрировано со стандартными установками электрофизиологии подвергать микромасштабной поверхности мозга срез в хорошо контролируемым образом, чтобы различные нейромедиаторы.
Abstract
Мы показали, изготовление двухуровневой микрожидкостных устройство, которое может быть легко интегрирована с существующими установками электрофизиологии. Двухуровневая микрожидкостных устройства изготовлены с использованием двухступенчатой стандартные отрицательные сопротивляться процесса литографии 1. Первый уровень содержит микроканалов с впускные и выпускные отверстия на каждом конце. Второй уровень содержит микромасштабной круглые отверстия расположен на полпути от длины канала и по центру, а также ширины канала. Пассивный насосных метод используется для перекачки жидкостей из входного отверстия к выходному порту 2. Микрожидкостных устройство интегрирован с вне готовых камер перфузии и позволяет полную интеграцию с установки электрофизиологии. Жидкости представлен на входе потока через порты микроканалов к розетке порты, а также выходить через круглые отверстия расположены на верхней части микроканалов в ванну перфузии. Таким образом, нижней поверхности мозга срез помещают в ванну камеры перфузии и выше микрожидкостных устройство может подвергаться воздействию различных нейромедиаторов. Микромасштабной толщина микрожидкостных устройств и прозрачным характером материалов [покровное стекло и PDMS (полидиметилсилоксан)] используется, чтобы сделать микрожидкостных устройств позволяют микроскопии мозга срез. Микрожидкостных устройство позволяет модуляции (как пространственные, так и временных) на химические раздражители представлен микросреды мозга срез.
Protocol
SU-8 плесень изготовления
Мастер подготовки
- SU-8 мастер на подложке пластины кремния подготовлен с использованием двухступенчатой стандартные отрицательные сопротивляться процесса литографии.
- Знаков совмещения на пластине кремния удаляют с помощью лезвия бритвы, как высота этих структур (расположены вдоль внешней периферии пластины) больше, чем фактическая приборных структур.
- Кремниевой пластины, затем очистить с помощью изопропилового спирта и сушат в потоке N 2. Поддержка столбы, изготовленные из ленты толщиной менее высоким структуру устройства заменить знаков совмещения с четырех сторон пластины.
Примечание: Если высота столпа поддержки более высоких зданий устройство, через отверстия не образуются в форме PDMS. - Пластины кремния мастера помещается на горячей плите при комнатной температуре.
PDMS приготовления раствора
- Четыре грамма полидиметилсилоксан (PDMS) раствор готовят тщательного перемешивания 10 частей силиконового эластомера с 1 частью отвердителя.
Примечание: Убедитесь, что два решения смешанных равномерно, чтобы получить аналогичные физические свойства на протяжении плесень PDMS. - Пузырьками генерируется в решение PDMS в процессе смешивания происходит с помощью вакуум-эксикаторе.
PDMS покрытия и отверждения
- Без пузырей решение PDMS медленно обойтись на СУ-8 мастер убедившись, что пузыри не генерируются во время процесса дозирования.
- Один конец записи на прозрачной пленке помещают на горячую тарелку и медленно сделан на решение PDMS, чтобы равномерно распределить PDMS на СУ-8 хозяина. Любые пузыри во время этого процесса должны быть удалены с помощью зонда.
[Примечание: Не поднимайте прозрачности для предотвращения образования пузырей больше.] - BOROFLOAT плита находится в верхней части листа прозрачности применять равномерное давление. Нежный давлении на верхней поверхности из самых высоких круговых структур (расположен на полпути от длины канала и по центру по ширине каналов) такое, что существует минимальный или нет PDMS зажатой между прозрачностью и SU-8 поверхности кругового структур.
- Еще три плиты BOROFLOAT помещаются поверх кремниевой пластины-BOROFLOAT плиты сэндвич применять постоянное давление на верхней поверхности кольцевых структур открытия до и во время процесса вулканизации.
- Температура горячей пластиной, затем увеличилась до 75 ° С и PDMS лечится при этой температуре в течение 1 часа. Плитке доводят до температуры 50 ° C.
- Плиты удаляют и прозрачность аккуратно удалена оставляя за хозяином и тонкий лист PDMS покрытие поверх нее.
Строительство микрожидкостных устройств
Удаление листов PDMS от мастера
- Внешняя граница перфузии камере вырезал на листе PDMS использованием лезвия бритвы после согласования портов перфузии камера с портами на СУ-8 хозяина.
- Лист PDMS затем аккуратно удалить из мастера, потянув вдоль каналов, чтобы предотвратить разрыв PDMS. Лист PDMS делается на прозрачности лист с микрожидкостных наземной сети вверх.
- Впускные и выпускные отверстия, затем с использованием пробки буром.
Склеивание листов PDMS на стекло покровное
- Связь поверхности листа PDMS (поверхность, содержащую микрожидкостных сети) и стекло покровное, затем аккуратно очистить с помощью ленты 3М скотч, размещенных на лист прозрачной пленки, и, наконец, размещены в O 2 плазменной камеры.
- Склеиваемые поверхности обрабатываются с 165 Вт плазмы в течение 10 с Плазмы обрабатываемой поверхности стекла покровного сразу связан с плазменной обрабатываемой поверхности листа PDMS.
Применение: мягкое давление на стеклянную поверхность, чтобы удалить пузырьки воздуха в ловушке между склеиваемые поверхности. - Разрешить 5 минут, чтобы получить хорошие связи между PDMS и стекла. Через 5 минут аккуратно удалить прозрачности, на котором лист PDMS был помещен для склеивания процесса.
- Микрожидкостных устройство помещается в системе кислородной плазмы, чтобы каналы гидрофильными. Плазменной обработки происходит при 165 Вт в течение 1 минуты.
Интеграция микрожидкостных устройств и перфузии камеры
Подготовка перфузии камеры
- Вне готовых перфузии камере было приказано, и впускные и выпускные отверстия были пробурены так что, когда микрожидкостных устройства и камеры связаны, портов камеры и устройства приведены в соответствие. Нижняя поверхность перфузии камеры покрыта PDMS получить герметичное уплотнение между камерой и микрожидкостных устройств.
- Записи о прозрачности лист помещается на горячей плите при комнатной температуре.
- Один грамм PDMS раствор готовят в процесс, аналогичный описанному ранее. Без пузырей решение PDMS затем медленно обойтись на прозрачность листов избегая поколения пузырьков.
- Перфузии камеру помещают на решение PDMS.
- BOROFLOAT плиты затем помещается в верхней части камеры применять равномерное давление и получить тонкое покрытие PDMS на нижней поверхности камеры.
- Температура горячей пластиной, затем увеличилась до 75 ° С и PDMS лечится при этой температуре в течение 1 часа.
Склеивание микрожидкостных устройств и перфузии камеры
- Плита удаляется, а прозрачность осторожно удалить оставив позади камеры перфузии и тонкий лист PDMS покрытием на нижней поверхности. Нежелательные PDMS удаляется с помощью лезвия бритвы и резкое зонда для удаления из PDMS доступа к портам.
- Поверхность PDMS из микрожидкостных устройства и поверхности PDMS нижней части камеры затем аккуратно очистить с помощью ленты 3М, размещенных на лист прозрачной пленки, и, наконец, помещен в камеру плазме кислорода.
- Поверхности обрабатывают 165 Вт плазмы в течение 10 с PDMS покрытием поверхности камеры непосредственно связаны с поверхностью из PDMS микрожидкостных устройств.
Применение: мягкое давление на стеклянную поверхность, чтобы удалить пузырьки воздуха в ловушке между склеиваемые поверхности. - Непосредственно перед использованием, устройство помещается в системе кислородной плазмы, чтобы каналы гидрофильными. Плазменной обработки происходит при 165 Вт в течение 1 минуты.
Разоблачение мозга ломтики в нейрохимические микроокружения использованием микрожидкостных устройств
- Гидрофильные микроканалах (микрожидкостных устройств) - (перфузии камеры) сочетание заполнены стандартными ACSF (искусственный спинномозговой жидкости) решение.
- Внесите небольшие капли раствора ACSF на входе в порт и позволяют решение, которое будет злой вверх в каналах. Удалите пузырьки влево с помощью шприца с выходной порт. Внесите большой каплю раствора ACSF на выходе из порта в пассивном перекачки жидкости от входа до выхода порты микрожидкостных устройств.
Примечание: Следует проявлять осторожность, чтобы удалить все пузырьки из каналов, чтобы поток жидкости с использованием пассивных метода накачки. - Fix (микрожидкостных устройств) - (перфузии камеры) комбо в простой платформы и исправить простой платформы в микроскоп адаптера.
- Подключите стандартный вход и выход (всасывания) трубку к перфузионной камере для непрерывной перфузии мозга срез раствором стандартного ACSF. Решение ACSF постоянно атмосферный с 95% О2-5% СО 2.
Примечание: Отрегулируйте положение всасывающий трубопровод для поддержания постоянного уровня ACSF в ванну перфузии камеры. - После перфузии камера заполняется раствором ACSF, место среза мозга в перфузионной камере помощью капельницы. Использование зонда, должность мозга срез выше круглых отверстий в микрожидкостных устройств. Как только срез мозга в нужном месте в течение круглых отверстий, используйте кусочек якорь для иммобилизации мозга срез.
- Микрожидкостных устройств теперь может быть использован, чтобы разоблачить мозга срезов (помещен в камеру перфузии и на вершине микрожидкостных сеть) для различных нейромедиаторов с использованием пассивных перекачки жидкостей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существующие макромасштабе или микромасштабной мозга камер ломтик перфузии ограничены с точки зрения пространственного разрешения, которые они предоставляют подвергать мозг ломтики нейромедиаторов. Микрожидкостных технологии устройства продемонстрировали здесь преодолевает это ограничение, используя простые методы bioMEMS. Ожидается, что простота в изготовлении микрожидкостных устройства и простоту в интеграции с существующими установками электрофизиологии позволит широкому применению продемонстрировал устройство технологий. Интересные эксперименты, которые были невозможны ранее, могут быть выполнены с текущей микрожидкостных устройств. Различные микросреды мозга срез может подвергаться воздействию различных нейромедиаторов в различных масштабах времени. Текущий прототип устройства включает в себя всего четыре параллельных каналов и круглые отверстия расположены рядом друг с другом. Тем не менее, это устройство макета может быть легко изменена путем реализации различных проектов, которые имеют отверстия разной формы и размеров, или микроканалов может быть извивалась в моду, что привело бы к позиционированию отверстий в различных микросреды мозга ломтиками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы открыты для сотрудничества с участием продемонстрировали микрожидкостных технологий в различных областях биологии.
Acknowledgments
Финансирование было предоставлено NIH MH-64611 и NARSAD премия для молодых следователь. Авторы также хотели бы отметить Адам Бигли, Марк Dikopf, и Бен Смит за техническую помощь.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-26GPL | Tool | Warner Instruments | W2-64-0236 | Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber |
| SHD-26GH/10 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0253 | Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit |
| Plasma Preen-II 862 | Tool | Plasmatic Systems, Inc. | Microwave plasma system | |
| Model P-1 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0277 | Series 20 Plain Platform, Model P-1 |
| SA-NIK | Tool | Warner Instruments | W2-64-0291 | Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK |
| Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid) | Reagent | Exact composition will vary with application |
References
- Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment. Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).
- Walker, G. M., Beebe, D. J. A passive pumping method for microfluidic devices. Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).
