Summary
Wir zeigen die Herstellung eines einfachen Mikrofluidik-Gerät, das mit Standard-Elektrophysiologie-Setups integriert werden kann, um mikro-Oberflächen eines Hirnschnitt in einer gut kontrollierten Weise zu verschiedenen Neurotransmittern aussetzen.
Abstract
Wir haben die Herstellung eines Zwei-Ebenen-Mikrofluidik-Gerät, das leicht in bestehende Elektrophysiologie Setups integriert werden demonstriert. Die Zwei-Ebenen-Mikrofluidikvorrichtung wird unter Verwendung eines zweistufigen Standard-Negativ-Resist-Lithographie-Prozess 1. Die erste Stufe enthält Mikrokanäle mit Einlass-und Auslasskanäle an jedem Ende. Die zweite Ebene enthält mikroskaligen kreisrunde Löcher auf halbem Weg von der Kanallänge und zusammen mit Kanalbreite zentriert. Passive Pumpen-Methode wird verwendet, um Flüssigkeiten von der Einlassöffnung zu der Auslassöffnung 2 Pumpe. Die mikrofluidischen Gerät ist mit off-the-shelf Perfusionskammern integriert und ermöglicht die nahtlose Integration mit der Elektrophysiologie-Setup. Die Flüssigkeiten am Eingang-Ports fließen durch die Mikrokanäle zum Auslass-Anschlüsse eingeführt und auch durch die kreisrunden Öffnungen auf der Oberseite der Mikrokanäle in das Bad der Perfusion befindet entkommen. So ist die untere Fläche des Gehirns Scheibe in der Perfusionskammer Bad und über der Mikrofluidikvorrichtung platziert werden können mit verschiedenen Neurotransmittern ausgesetzt werden. Die mikro-Dicke der Mikrofluidik-Gerät und die transparente Beschaffenheit der Materialien [Deckglas und PDMS (Polydimethylsiloxan)] verwendet werden, um die Mikrofluidikvorrichtung ermöglichen Mikroskopie des Gehirns in Scheiben schneiden. Die mikrofluidischen Gerät ermöglicht Modulation (sowohl räumlich und zeitlich) der chemischen Reize eingeführt, um die Hirnschnitt Mikroumgebungen.
Protocol
SU-8 Formenbau
Master-Vorbereitung
- Die SU-8 Master auf Silizium-Wafer-Substrat wird unter Verwendung eines zweistufigen Standard-Negativ-Resist Lithographie-Prozess.
- Die Ausrichtungsmarkierungen auf dem Silizium-Wafer werden mittels einer Rasierklinge die Höhe dieser Strukturen (befindet sich entlang der äußeren Peripherie des Wafers) ist mehr als das eigentliche Gerät Strukturen.
- Die Silizium-Wafer wird dann gereinigt mit Isopropylalkohol gewaschen und in einem N 2-Strom. Stützpfeiler aus Band mit einer Dicke von weniger als der höchste Gerät Struktur ersetzen die Ausrichtungsmarkierungen auf vier Seiten des Wafers.
Hinweis: Wenn die Stützpfeiler Höhe ist mehr als das höchste Gerät Strukturen, die durch die Löcher sind nicht im PDMS Schimmel gebildet. - Der Master-Silizium-Wafer ist auf einer heißen Platte an der Raumtemperatur vorgelegt.
PDMS-Aufbereitung
- Vier Gramm Polydimethylsiloxan (PDMS)-Lösung wird durch gründliches Mischen 10 Teile aus Silikon-Elastomer mit 1 Teil Härter vorbereitet.
Hinweis: Achten Sie darauf, dass die beiden Lösungen gleichmäßig auf ähnliche physikalische Eigenschaften in der PDMS Form erhalten wurde. - Die Blasen in der PDMS-Lösung beim Mischen erzeugt werden entfernt mit einem Vakuum-Exsikkator.
PDMS-Beschichtung und Aushärtung
- Die blasenfreie PDMS Lösung wird langsam auf die SU-8 Master dafür sorgen, dass Blasen, nicht während der Abgabe Prozess erzeugt verzichtet.
- Ein Ende eines Schreib-on Transparenz Film wird dann auf der Heizplatte gestellt und langsam auf dem PDMS-Lösung gelegt, um gleichmäßig verteilt die PDMS auf die SU-8-Master. Jede Blasen während dieses Prozesses generiert, müssen beseitigt mit Hilfe einer Sonde werden.
[Hinweis: Heben Sie die Transparenz der Erzeugung von mehr Blasen zu verhindern.] - Ein Borofloat Platte befindet sich oben auf die Transparenz Blatt, um eine einheitliche Druck auszuüben platziert. Sanfter Druck auf der Oberseite der höchsten kreisförmige Strukturen (auf halbem Weg der Kanallängen und zentriert entlang der Breite der Kanäle), so dass es keine oder nur minimale PDMS eingeklemmt zwischen der Transparenz und der SU-8 Oberfläche der kreisförmigen angewendet Strukturen.
- Drei weitere Borofloat Brammen werden auf der Oberseite des Silizium-Wafer-Borofloat Platte Sandwich um einen konstanten Druck auf der Oberseite der kreisförmigen Öffnung Strukturen vor und während der Aushärtung gelten platziert.
- Die Temperatur der heißen Platte wird dann auf 75 ° C erhöht und die PDMS ist bei dieser Temperatur 1 Stunde gehärtet. Die Heizplatte wird auf eine Temperatur von 50 ° C gebracht
- Die Platten werden entfernt und die Transparenz wird sanft entfernt und hinterließ der Meister und die dünne PDMS Blatt oben drauf beschichtet.
Der Bau der Mikrofluidikvorrichtung
Entfernung von PDMS Blatt vom Meister
- Die äußere Begrenzung des Perfusionskammer erfolgt auf der PDMS Blatt mit einer Rasierklinge nach dem Ausrichten der Anschlüsse auf der Perfusionskammer mit den Häfen an der SU-8 Master geschnitzt.
- Die PDMS Blatt wird dann vorsichtig aus dem Master entfernt, zieht sich entlang der Länge der Kanäle zu verhindern Reißen PDMS. Die PDMS Blatt ist auf einer Transparenz Blatt mit der mikrofluidischen Netzwerk Oberfläche nach oben gelegt.
- Die Einlass-und Auslasskanäle werden dann unter Verwendung einer Korkbohrer.
Kleben von PDMS Blatt zu Deckglas
- Die Klebefläche des PDMS Blatt (die Oberfläche mit der Mikrofluidik-Netz) und einem Deckglas werden dann schonend gereinigt mit einem 3M Scotch Tape, platziert auf einem Blatt der Transparenz, und schließlich in der O 2 Plasmakammer gelegt.
- Die Klebeflächen sind mit 165 Watt Plasma für 10 s. behandelt Das Plasma behandelte Oberfläche des Deckglases wird sofort an das Plasma behandelte Oberfläche des PDMS geklebt.
Hinweis: Wenden Sie sanften Druck auf die Glasoberfläche, um mögliche Luftblasen zwischen den Klebeflächen gefangen zu entfernen. - Lassen Sie 5 Minuten, um eine gute Bindung zwischen dem PDMS und Glas zu erhalten. Nach 5 Minuten entfernen Sie vorsichtig die Transparenz auf dem die PDMS Blatt für die Bonding-Prozess gelegt wurde.
- Die mikrofluidischen Gerät ist in der Sauerstoff-Plasma-System, um die Kanäle hydrophilen platziert. Die Plasma-Behandlung ist bei 165 Watt für 1 Minute.
Integration von mikrofluidischen Gerät und Perfusionskammer
Vorbereitung der Perfusionskammer
- Eine off-the-shelf Perfusionskammer bestellt wurde, und Einlass-und Auslasskanäle wurden gebohrt, so dass, wenn die Mikrofluidik-Gerät und die Kammer gebunden sind, die Anschlüsse an die Kammer und das Gerät ausgerichtet werden. Die untere Fläche des Perfusionskammer ist mit P beschichtetDMS um eine gute Abdichtung zwischen der Kammer und der mikrofluidischen Gerät zu erhalten.
- Ein Schreib-on Transparenz Blatt ist auf einer heißen Platte an der Raumtemperatur vorgelegt.
- Ein Gramm PDMS-Lösung wird in einem Prozess ähnlich wie oben beschrieben vorbereitet. Die blasenfreie PDMS-Lösung wird dann langsam auf die Transparenz Blatt Vermeidung Generation von Blasen verzichtet.
- Die Perfusionskammer wird dann auf dem PDMS-Lösung gelegt.
- Ein Borofloat Platte wird dann auf der Oberseite der Kammer um eine gleichmäßige Druck auszuüben und zu einer dünnen Beschichtung von PDMS an der Bodenfläche der Kammer zu erhalten platziert.
- Die Temperatur der heißen Platte wird dann auf 75 ° C erhöht und die PDMS ist bei dieser Temperatur 1 Stunde gehärtet.
Bonding von mikrofluidischen Gerät und Perfusionskammer
- Die Platte wird entfernt und die Transparenz wird sanft entfernt werden, wobei hinter dem Perfusionskammer und die dünne PDMS beschichtetes Blech auf der unteren Fläche. Unerwünschte PDMS entfernt mit einer Rasierklinge und einer scharfen Spitze Sonde für PDMS Entnahme aus Access-Ports.
- Die PDMS Oberfläche des mikrofluidischen Gerät und dem PDMS Bodenfläche der Kammer werden dann schonend gereinigt mit einem 3M Klebeband, platziert auf einem Blatt der Transparenz, und schließlich in der Sauerstoff-Plasma-Kammer gelegt.
- Die Oberflächen sind mit 165 Watt Plasma für 10 s. behandelt Die PDMS beschichtete Oberfläche der Kammer sofort an der PDMS-Oberfläche des Mikrofluidikvorrichtung verklebt.
Hinweis: Wenden Sie sanften Druck auf die Glasoberfläche, um mögliche Luftblasen zwischen den Klebeflächen gefangen zu entfernen. - Unmittelbar vor dem Gebrauch wird das Gerät in der Sauerstoff-Plasma-System, um die Kanäle hydrophilen platziert. Die Plasma-Behandlung ist bei 165 Watt für 1 Minute.
Offenlegen von Hirnschnitten zu neurochemischen Mikroumgebung mit dem Mikrofluidikvorrichtung
- Die hydrophile Mikrokanäle der (Mikrofluidik-Gerät) - (Perfusionskammer) Kombination mit Standard-ACSF (Artificial Rückenmarksflüssigkeit)-Lösung gefüllt.
- Dispense kleinen Tropfen ACSF-Lösung am Eingang-Ports und lassen Sie die Lösung, böse zu sein bis in die Kanäle. Entfernen Sie alle Luftblasen links mit einer Spritze aus dem Auslass. Dispense eine große Tropfen ACSF-Lösung an der Auslassöffnung zu ermöglichen passive Abpumpen von Flüssigkeiten vom Einlass zum Auslass-Ports des Mikrofluidikvorrichtung.
Hinweis: Achten Sie darauf, um alle Luft aus den Kanälen zu entfernen, um Strömung von Flüssigkeiten mittels passiver Pumpen-Methode zu ermöglichen. - Fix die (Mikrofluidik-Gerät) - (Perfusionskammer) Combo in der Ebene Plattform und fixieren die Ebene Plattform in das Mikroskop-Adapter.
- Schließen Sie die Standard-Ein-und Auslass (Saug-) Schlauch an den Perfusionskammer für die kontinuierliche Perfusion des Gehirns Scheibe mit Standard-ACSF Lösung. Die ACSF Lösung wird kontinuierlich mit 95% O2-5% CO 2 angesaugt.
Hinweis: Passen Sie die Position der Saugleitung zu konstanten Niveau von ACSF in das Bad der Perfusionskammer aufrecht zu erhalten. - Sobald die Perfusionskammer mit ACSF-Lösung gefüllt ist, legen Sie ein Hirnschnitt in der Perfusionskammer mit Hilfe einer Pipette. Mit einer Sonde, positionieren Sie den Hirnschnitt über der runden Öffnungen in der Mikrofluidik-Gerät. Sobald das Gehirn Scheibe an der gewünschten Position über der runden Öffnungen, verwenden Sie ein Stück Anker an das Gehirn Scheibe zu fixieren.
- Die mikrofluidischen Gerät kann nun verwendet werden, um den Hirnschnitten (platziert in der Perfusionskammer und auf der Oberseite des mikrofluidischen network) auf verschiedene Neurotransmitter mit passiven Abpumpen von Flüssigkeiten ausgesetzt werden.
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Discussion
Bestehende makroskopischen oder mikro Hirnschnitt Perfusionskammern sind in Bezug auf die räumliche Auflösung bieten sie an Hirnschnitten mit Neurotransmittern aussetzen begrenzt. Die Mikrofluidikvorrichtung Technologie demonstriert hier überwindet diese Einschränkung mit einfachen BioMEMS Techniken. Es wird erwartet, dass die Einfachheit in der Herstellung der Mikrofluidik-Gerät und die Leichtigkeit in die Integration mit bestehenden Elektrophysiologie Setups wird weit verbreitete Anwendung der Beweis Gerätetechnik ermöglichen. Interessante Experimente, die nicht möglich waren früher kann mit der aktuellen Mikrofluidikvorrichtung durchgeführt werden. Verschiedene Mikroumgebungen des Gehirns Scheibe kann auf verschiedene Neurotransmitter an verschiedenen Zeitskalen ausgesetzt werden. Der aktuelle Prototyp umfasst nur vier parallele Kanäle und runde Öffnungen neben einander. Allerdings kann dieses Gerät Layout leicht durch die Umsetzung verschiedener Designs, die Öffnungen in verschiedenen Formen oder Größen oder die Mikrokanäle in einer Weise, dass die Positionierung der Öffnungen in verschiedenen Mikroumgebungen Hirnschnitten führen würde könnte schlängelte verändert werden würde.
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Disclosures
Die Autoren sind offen für Kooperationen mit der nachgewiesen Mikrofluidik-Technologie auf verschiedene Bereiche der Biologie.
Acknowledgments
Die Finanzierung wurde durch die NIH MH-64611 und NARSAD Young Investigator Award zur Verfügung gestellt. Die Autoren möchten auch Adam Beagley, Mark Dikopf und Ben Smith für ihre technische Unterstützung zu bestätigen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-26GPL | Tool | Warner Instruments | W2-64-0236 | Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber |
| SHD-26GH/10 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0253 | Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit |
| Plasma Preen-II 862 | Tool | Plasmatic Systems, Inc. | Microwave plasma system | |
| Model P-1 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0277 | Series 20 Plain Platform, Model P-1 |
| SA-NIK | Tool | Warner Instruments | W2-64-0291 | Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK |
| Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid) | Reagent | Exact composition will vary with application |
References
- Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment. Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).
- Walker, G. M., Beebe, D. J. A passive pumping method for microfluidic devices. Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).
