Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إعداد Pyrophosphates إينوسيتول الجودة

Published: September 3, 2011 doi: 10.3791/3027
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Medical Research Council (MRC), Cell Biology Unit and Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London

Summary

pyrophosphates اينوزيتول تلعب دورا هاما في أمراض السرطان مثل الإنسان ، والسكري والسمنة ، إلا أن الآلية الدقيقة لعمل هو موضع خلاف. عدم وجود pyrophosphates اينوزيتول المتاحة تجاريا يجعل دراسات تفصيلية للمشاكل. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة لإنتاج وعزل ملليغرام من pyrophosphates اينوزيتول.

Protocol

1. رد الفعل الأنزيمية -- يوم 1 (1 ساعة بعد الظهر)

  1. الخطوة الأولى هي إعداد 10-20 التفاعلات الإنزيمية المستقلة التي IP 6 K1 أو تحويل الملكية الفكرية VIP1 6 إلى الأشكال الإسوية pyrophosphorylated.
  2. نحن نستخدم له 6 - IP K1 والانزيمات GST - Vip1 تنقيته من E. القولونية وفقا لبروتوكول 17،18 الموصوفة سابقا.
  3. تجهيز 50 ميكرولتر تحتوي على ردود فعل رد فعل 1X العازلة (Hepes 30 ملم 6.8 درجة الحموضة ، و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 6 مم MgSO 4 ، 1 ملم DTT) ، 6 فسفوكرياتين ملم (PCR) ، و 25 يو / مل CreatinePhosphoKinase (CPK) ، 5 مم ATP (ملغ الملح) ، 0.3 ملي IP6 ، 0،05-0،1 ميكروغرام صاحب IP - 6 K1 أو ضريبة السلع والخدمات Vip1. ضبط مستوى الصوت مع 2 MiliQ O. DDH
  4. تدور لفترة وجيزة في رد الفعل واحتضان 37 درجة مئوية خلال الليل مع التناوب.

2. بولي أكريلاميد صب جل والتحميل -- يوم 2 (4 ساعات بعد الظهر)

  1. يتم تحضير هلام بولي أكريلاميد باستخدام 24 سم ، 18 سم لوحات زجاجية واسعة والفواصل واسعة 1.5 مم. وعادة ما يتم استخدام ممر 16 أو مشط التحضيرية حارة واحدة.
  2. تحضير مزيج (50 مل / جل) يحتوي على ما يلي : 35.5 ٪ (W / V) الأكريلاميد : مكرر الأكريلاميد 19:01 ، 1X بيرسلفات الأمونيوم تريس / البورات / EDTA (TBE) ، 0.05 ٪ (W / V) (وكالة الأنباء الجزائرية ) ، Temed 0.05 ٪ (W / V). صب مزيج بين لوحات ما قبل محمل الزجاج ، وادخال المشط والسماح للتبلمر 30-60 دقيقة في RT.
  3. مرة واحدة في هلام وبلمرة ، ونقل الجهاز إلى غرفة باردة وقبل تشغيله في TBE 1X لحوالي 30-60 دقيقة على 200-300 فولت.
  4. إضافة 1X صبغة OrangeG (10 ملي تريس - pH7.0 حمض الهيدروكلوريك ، 1 ملم EDTA ، الجلسرين 30 ٪ ، 0.1 ٪ OrangeG) إلى كل التفاعل. تحضير عينة تحتوي على 2 nmol الملكية الفكرية 6 الى تحميل كعنصر تحكم القياسية.
  5. يغسل جيدا جيدا مع كل تشغيل العازلة باستخدام المحاقن والإبر 21G لإزالة أي يعجل ، ثم تحميل الجل. تجنب التحميل على الآبار الجانبية.
  6. تشغيل هلام بين عشية وضحاها على 450-550 فولت (7 mAmp / هلام) ، حتى الفرقة صبغ OrangeG ضمن مشاركة 10 سم من الجزء السفلي من هلام.

3. بمعزل عن الملكية الفكرية 7 -- يوم 3 (4 ساعات) ، ويوم 4 (6-7 عملية التجفيف SpeedVac ساعة)

  1. تفكيك جهاز هلام بعناية وإزالة إحدى الصفائح الزجاجية ترك الجل على الآخر. قطع جزء صغير من الجل من فوق الشريط صبغ OrangeG إلى القاع الذي يحتوي على 6 من IP القياسية ومسار واحد العينة ، كما هو مبين في الشكل 1.
  2. وصمة عار على قطع جزء من هلام مع الأزرق طولويدين (0.1 ٪ (W / V) طولويدين الزرقاء ، و 20 ٪ (W / V) والميثانول ، 2 ٪ (W / V) الجلسرين) لبضع دقائق (1-3 دقائق) أو حتى الفرقة بيروفوسفات اينوزيتول تظهر. وضع لوحة من الزجاج الخلفي إزالة سابقا على رأس لمنع هلام هلام غير ملوثين من التجفيف.

ينبغي أن الفرقة الملكية الفكرية 7 تكون مرئية منذ تشغيله بشكل أبطأ قليلا من مستوى 6 IP. وينبغي للاعبي التنس المحترفين ، والذي يعمل بشكل أسرع من 6 الملكية الفكرية ، وأيضا أن تكون مرئية (الشكل 1). نقل الجزء الملون من هلام في التوصل إلى حل لإزالة البقع (20 ٪ (W / V) الميثانول) لبضع دقائق ، يغسل أي فائض في الزرقاء وإعادة طولويدين الجل مع الجل غير ملوثين.

إذا كان مطلوبا التصور العالي الأشكال الإسوية اينوزيتول pyrophosphorylated (IP IP 8 و 9) ، وصمة عار الجل مع الحل طولويدين تلطيخ الأزرق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، يغسل الأزرق طولويدين مع الحل دي تلطيخ لحوالي 15 دقيقة.

  1. مع خفض شفرة حلاقة الملكية الفكرية 7 الفرقة على الجزء غير ملوثين من هلام به كمرجع للملكية الفكرية موقف ترحيل 7 العزم مع الجل الملون (الشكل 1).
  2. وضع الملكية الفكرية 7 الفرقة التي قطعت من الجل على أنبوب 15 مل و 10 مل من إضافة 2 MilliQ O. DDH وضع الأنابيب في التناوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. رفض السائل لإزالة الفائض من جزيئات الأكريلاميد TBE والمجهرية.
  3. بعد ذلك ، نفذ two - جفاف الماء دورات. إضافة 5 مل من 50 ٪ (W / V) الميثانول إلى أنبوب مع هلام يحتوي على 7 الملكية الفكرية وتدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. نقل شريحة هلام لأنبوب جديد 15 مل تحتوي على 5 مل من 2 MilliQ O DDH وتدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. لا يتخلص من الميثانول وMilliQ H O 2 من الأنابيب. تكرار الجفاف دورة الماء مرة أخرى ، من خلال إعادة نقل هلام بولي أكريلاميد في 15 مل من الأنابيب المستخدمة سابقا. لا يمكن أن يؤديها واحد من يغسل طوال الليل.
  4. لتركيز IP eluted 7 ، جفاف 10 مل معا (5 مل MilliQddH 2 O و 5 مل 50 ٪ الميثانول (ث / ت)) باستخدام SpeedVac ساخنة عند 60 درجة مئوية.
  5. مرة واحدة على عينات جافة تقريبا ، ونقل السائل المتبقي (300-600 ميكرولتر) لa1.5 مل أنبوب الطرد المركزي وتدور لمدة 2 دقيقة في 5000 دورة في الدقيقة.
  6. طاف جمع ونقل الى الطازجة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي ؛ مغادرةأسفل 20-30 ميكرولتر أنها قد تحتوي على جزيئات الأكريلاميد.
  7. إذا كان ذلك ضروريا الاستمرار في عملية التجفيف باستخدام SpeedVac غير مدفأة. وخفضت بشكل كبير في انتعاش IP 7 إذا العينات يجف تماما ، ثم إنهاء عملية التجفيف عندما تصل عينات حجم 100-300 ميكرولتر.

4. تحديد تركيز 7 الملكية الفكرية والنقاء.

  1. استخدام 2-5 ميكرولتر من العينة تعافى 7 IP لتشغيل على هلام PAGE ، على غرار الأقسام 2،2-2،5. تحميل العديد من التخفيفات IP 6 (أي 0.5 ، 1 ، 2 ، 4 nmol) وفقا لمعايير وتركيز 4 nmol من بولي - P علامة. بعد تشغيل هلام ، تصور الأشكال الإسوية بيروفوسفات اينوزيتول بواسطة تلطيخ واجتثاث تلطيخ الجل كامل مع حل طولويدين الأزرق ، وبعد الإجراء الموضح في القسم 3.2 (الشكل 2A).
  2. بعد تلطيخ طولويدين ، يمكن تحديد التركيزات عن طريق مسح الجل ومقارنة الاختلافات في كثافة تتراوح بين 6 الملكية الفكرية والملكية الفكرية 7 ، وذلك باستخدام برامج التصوير مثل J - الصور ، كما هو مبين في الشكل 2B.

5. ممثل النتائج :

ويمكن تحويل التحضيرية الأنزيمية للملكية الفكرية من 6 إلى 7 باستخدام IP IP 6 K1 وVIP1 الانزيمات حلها بسهولة باستخدام التحليل PAGE (الشكل 1). التحميل من 6 الملكية الفكرية باعتبارها التحكم في حجم جنبا إلى جنب مع تلوين طولويدين الجل الأزرق يتيح التعرف على المشتقات pyrophosphorylated ، حيث أنها تعمل بشكل أبطأ اعتمادا على عدد من المجموعات الفوسفات الموجودة على الحلبة اينوزيتول. الإجراء المذكورة أعلاه يسمح للتنقية سهلة من 7 IP. وكشف تحليل لبيروفوسفات اينوزيتول يطهر PAGE نقاء الملكية الفكرية لدينا 7 (الشكل 2A). ومن المثير للاهتمام ، و1/3PP-IP 5 ايزومير من الناتج 7 IP من VIP1 يهاجر أبطأ قليلا من أيزومر 5 5PP - IP من 7 IP التي تم إنشاؤها بواسطة K1 6 IP. 6 استخدام معايير الملكية الفكرية تسمح الكمي سهلة للتركيز IP المنقى 7 (الشكل 2B). 7 قبل استخدام الملكية الفكرية لمزيد من التجارب ، يمكن تقييم نشاطها البيولوجي
(الشكل 3). 5PP - IP هو المحتضنة 5 مع VIP1 ومع الفوسفاتيز 7 IP DDP1 (diphosphoinositol phosphohydrolase متعددة الفوسفات). بشكل روتيني ، يتم تحويل الملكية الفكرية تنقيته من 7 إلى 8 من VIP1 الملكية الفكرية والملكية الفكرية التي DDP1 6 (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1 : من تلطيخ طولويدين PAGE والعزلة من الفرقة الملكية الفكرية 7 قطع جزء من الجل الذي يحتوي على معيار (IP 6) والملون باستخدام حل طولويدين الأزرق. الفرق الثلاثة تمثل (من أعلى إلى أسفل) 7 IP ، IP 6 و ATP. ثم كان متحالفا الجزء الملون من هلام مع ما تبقى من هلام. هذا يسمح للتوطين جزء من هلام يحتوي على 7 الملكية الفكرية ، والتي يمكن بعد ذلك قص وتنقيته (مربع متقطع).

الشكل 2
الشكل 2 : تحليل PAGE الملكية الفكرية منتجات التفاعل 6 K1 وVIP1. أ) تم استخدام تحليل IP 6 (4 ، 2 ، 1 ، 0.5 nmol) عن طريق تلوين طولويدين الأزرق من أجل تحديد IP 7 تركيز تنقيتها من كل 6 IP K1 (IP - 5PP 5) وVIP1 (1/3PP-IP 5) ردود الفعل. B) مبعثر تحليل مؤامرة لتحديد تركيز الملكية الفكرية المنقى 7. وتم تحديد التركيزات وفقا لكثافة الموجات ، محسوبة باستخدام البرمجيات imageJ ، مقارنة كميات محددة مسبقا من 6 IP. والمحور السيني يمثل شدة ، ويمثل المحور Y - تركيزات التي أعرب عنها في nmol.

الشكل 3
الشكل 3 : تحليل النشاط 7 IP البيولوجي لتحديد نوعية الملكية الفكرية المنقى 7 المحتضنة نحن 5PP 5 - IP (IP 6 K1 IP ولدت 7) مع VIP1 أو مع الفوسفاتيز 7 DDP1 IP وحلها ثم رد الفعل على الصفحة. كشفت وتلطيخ دابي طولويدين الإنتاج المتوقع من 8 VIP1 الملكية الفكرية وتحويل الملكية الفكرية من 7 إلى 6 من DDP1 IP.

Discussion

غير محدودة بشدة استخدام بيروفوسفات اينوزيتول في الكيمياء الحيوية بسبب عدم توفر هذه المركبات التجارية وحساسية الفقيرة من طرق الكشف الحالية. مزيج من صفحة ، والذي تمكن من فصل الجزيئات التي تمتلك عدد مختلف من مجموعات الفوسفات ، وزرقة الطولويدين (الشكل 1) ، وصبغ متبدل اللون الذي يربط لمجموعات الفوسفات ، وتمكن من السهل اكتشاف الأشكال الإسوية pyrophoshate اينوزيتول فتح مجالات جديدة للبحث 20.

نفذت استخدام التكنولوجيا PAGE وصف لتنقية المنتجات بيروفوسفات اينوزيتول رد الفعل الأنزيمية outby إما 6 أو IP K1 VIP1 هو بسيط ، طريقة اقتصادية والموثوق بها التي تسمح لإنتاج كميات كبيرة من الملكية الفكرية ذات جودة عالية 7. لا يقتصر على الطريقة الموصوفة أعلاه لعملية تنقية بسيطة للملكية الفكرية 7 ولكن تعديلات طفيفة على البروتوكول صفها قد تسمح لتنقية مجموعة مختلفة من pyrophosphates اينوزيتول. ويمكن الكشف عن أعلى فسفرته الأشكال الإسوية بيروفوسفات اينوزيتول ، تحتوي على مجموعة الفوسفات أكثر من ثمانية باستخدام الملكية الفكرية (7) أو كميات مختلفة من 6 الملكية الفكرية باعتبارها الركيزة 20،6. ويمكن الكشف عن هذه pyrophosphates اينوزيتول من خلال زيادة طول تلطيخ الداخلي وتنقيته في وقت لاحق (القسم 3.2). علاوة على ذلك ، فإن استخدام الملكية الفكرية باعتبارها الركيزة 5 للتفاعل الأنزيمي السماح للتنقية PP - IP (5) وpyrophosphates اينوزيتول أخرى تحتوي على مجموعة الهيدروكسيل على الحلقة اينوزيتول.

في الختام ، وهذه الطريقة بسهولتها يسمح لتنقية موثوق بها كميات مليغرام من pyrophosphates اينوزيتول مع الأدوات المتاحة على نطاق واسع ، مما يفتح آفاقا جديدة لهذا الحقل البحوث المثيرة.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر ألف ريشيو عن التعليقات المفيدة وقراءة المخطوط. وأيد هذا العمل عن طريق تمويل البحوث الطبية (MRC) المجلس إلى خلية علم الأحياء وحدة الإنسان من قبل برنامج منح العلوم الحدودي (RGP0048/2009-C).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phytic Acid (IP6) Sigma-Aldrich P8810
Poly-P (sodium hexametaphosphate) Sigma-Aldrich P8510
ATP-Mg2+ salt Sigma-Aldrich A9187
OrangeG Sigma-Aldrich O3756
PhosphoCreatine (PCr) Sigma-Aldrich P7936
CreatinePhospho Kinase (CPK) Sigma-Aldrich C3755
His-Ddp1 Available in lab Available in lab
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) Flowgen H16972
Ammonium Persulfate (APS) Sigma-Aldrich A9164
Tris/Borate/EDTA (TBE) Sigma-Aldrich T 9060
Temed VWR 43083G
Toluidine Blue Sigma-Aldrich 198161
SpeedVac Christ 100218
Gel apparatus Hoeffer Scientific Instruments SE600
Vacuum manifold Christ Alpha 2-4
Vacuum pump ABM Greiffenberger 4EKF63CX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling. Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).
  2. Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. Are inositol pyrophosphates signalling molecules? J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).
  3. Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function. Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).
  4. Shears, S. B. Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers. Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).
  5. Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases. Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).
  6. Draskovic, P. Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups. Chem Biol. 15, 274-286 (2008).
  7. Mulugu, S. A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate. Science. 316, 106-109 (2007).
  8. Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases. J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).
  9. Illies, C. Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells. Science. 318, 1299-1302 (2007).
  10. Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).
  11. York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. Inositol diphosphate signaling regulates telomere length. J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).
  12. Luo, H. R. Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions. Cell. 114, 559-572 (2003).
  13. Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).
  14. Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).
  15. Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).
  16. Bhandari, R. Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).
  17. Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1). Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).
  18. Otto, J. C. Biochemical analysis of inositol phosphate kinases. Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).
  19. Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).

Tags

علم الأحياء الجزيئية ، العدد 55 ، Polyacrilamyde الكهربائي جل (صفحة) ، hexakisphosphate اينوزيتول (IP6) ، وحمض الفيتيك ، diphosphoinositol عليها اينوزيتول بنتاكيسفوسفات (IP7) ، tetrakisphosphate bisdiphoshoinositol (IP8) ، IP6 ، كيناز (IP6K) ، PP - IP5K ، VIP1
إعداد Pyrophosphates إينوسيتول الجودة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loss, O., Azevedo, C., Szijgyarto,… More

Loss, O., Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Bosch, D., Saiardi, A. Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates. J. Vis. Exp. (55), e3027, doi:10.3791/3027 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter