Summary
Pirofosfati inositolo svolgono un ruolo importante nelle patologie umane come il cancro, il diabete e l'obesità, ma l'esatto meccanismo d'azione è una questione di controversia. La mancanza di pirofosfati inositolo disponibili in commercio rende studi dettagliati problematico. Qui descriviamo un semplice protocollo per la produzione e isolare milligrammi di pirofosfati inositolo.
Abstract
Myo-inositolo è presente in natura sia senza modifiche o più derivati complessi fosforilata. Delle più recenti, il più abbondante nelle cellule eucariotiche due sono pentakisphosphate inositolo (IP 5) e hexakisphosphate inositolo (acido fitico o IP 6). IP 5 e IP 6 sono i precursori di molecole pirofosfato inositolo che contengono uno o più legami pirofosfato 1. Fosforilazione di IP 6 genera diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 o PP-IP 5) e bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 o (PP) 2-IP 4). Pirofosfati inositolo sono stati isolati da tutti gli organismi eucarioti sinora studiati. Inoltre, le due classi distinte di enzimi responsabili della sintesi pirofosfato inositolo sono altamente conservati durante l'evoluzione 2-4.
L'IP 6 chinasi (IP 6 Ks) possiede una flessibilità enorme catalizzatore, la conversione IP 5 e 6 al PP IP-IP IP 4 e 7 rispettivamente e successivamente, utilizzando questi prodotti come substrati, promuovere la generazione di molecole più complesse 5,6 . Recentemente, una seconda classe di enzimi pirofosfato generazione è stata individuata nella forma della proteina di lievito VIP 1 (noto anche come PP-IP 5 K), che è in grado di convertire IP da 6 a 7 e IP IP 8 7,8.
Pirofosfati inositolo regolano molti processi cellulari disparati quali la secrezione di insulina 9, la lunghezza dei telomeri 10,11, chemiotassi 12, il traffico vescicolare 13, 14 e omeostasi fosfato di HIV-1 gag rilascio 15. Due meccanismi di azione sono stati proposti per questa classe di molecole. Essi possono influenzare le funzioni cellulari da allosterically interagendo con proteine specifiche, come AKT 16. In alternativa, il gruppo pirofosfato può donare un fosfato di pre-fosforilata proteine 17. L'enorme potenziale di questo campo di ricerca è ostacolata dalla mancanza di una fonte commerciale di pirofosfati inositolo, che impedisce molti scienziati di studiare queste molecole e questa nuova modificazioni post-traduzionali. I metodi attualmente disponibili per isolare pirofosfati inositolo richiedono sofisticate apparecchiature cromatografiche 18,19. Queste procedure utilizzano condizioni di acidità che potrebbe portare al degrado pirofosfato inositolo 20 e quindi al recupero poveri. Inoltre, l'ingombrante post-colonna procedure di dissalazione limitarne l'uso a laboratori specializzati.
In questo studio descriviamo un metodo poco impegnativo per la generazione, l'isolamento e la purificazione dei prodotti di IP 6-chinasi e PP-IP 5-chinasi reazioni. Questo metodo è stato possibile grazie alla capacità di elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAG) per risolvere i polifosfati inositolo altamente fosforilata 20. A seguito di IP 6 K1 e PP-IP 5 K reazioni enzimatiche utilizzando IP 6 come il substrato, PAGINA è stato utilizzato per separare i pirofosfati generato inositolo che sono stati successivamente eluiti in acqua.
Protocol
1. La reazione enzimatica - giorno 1 (1 ora al pomeriggio)
- Il primo passo è quello di preparare 10-20 indipendente reazioni enzimatiche in cui IP 6 K1 o VIP1 convertire IP 6 al isoforme pyrophosphorylated.
- Utilizziamo His-IP 6 K1 e GST-VIP1 enzimi purificato da E. coli secondo il protocollo precedentemente descritto 17,18.
- Preparare 50 reazioni microlitri contenente 1X tampone di reazione (30 Hepes mM pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM fosfocreatina (PCr), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg sale), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 mg suo-IP 6 K1 o GST-VIP1. Regolare il volume con MiliQ DDH 2 O.
- Brevemente girare la reazione e incubare a 37 ° C durante la notte con rotazione.
2. Poliacrilammide colata gel e di carico - giorno 2 (4 ore al pomeriggio)
- Il gel di poliacrilammide si prepara a 24 cm di lunghezza, lastre di vetro 18 centimetri di larghezza e 1,5 mm di larghezza distanziatori. Di solito un 16 lane o un singolo pettine corsia preparativo viene utilizzato.
- Preparare una miscela (50 ml / gel) contenente le seguenti: 35,5% (w / v) di acrilammide: Bis-acrilamide 19:1, 1X Tris / Borato / EDTA (TBE), 0,05% (w / v) di ammonio persolfato (APS ), 0,05% (w / v) TEMED. Versate il mix tra il pre-lastre di vetro fuso, inserire il pettine e lasciare polimerizzare per 30-60 minuti a temperatura ambiente.
- Una volta che il gel è polimerizzato, trasferire l'apparecchiatura alla stanza fredda e pre-run in TBE 1X per circa 30-60 minuti a 200-300 Volt.
- Aggiungi 1X di OrangeG colorante (10 mM Tris-HCl pH7.0, 1 mM EDTA, 30% glicerolo, 0,1 OrangeG%) per ogni reazione. Preparare un campione contenente 2 nmol di IP da 6 a caricare come un controllo standard.
- Lavare ogni pozzetto a fondo con l'esecuzione buffer utilizzando una siringa e un ago 21G per rimuovere l'eventuale precipitato, quindi caricare il gel. Evitare di caricare nei pozzetti laterali.
- Esegui il gel notte a 450-550 Volt (7 mAmp / gel), fino a quando la band colorante OrangeG è da meno di 10 cm dal fondo del gel.
3. Isolamento di IP 7 - giorno 3 (4 ore) e il 4 ° giorno (6-7 ore SpeedVac processo di essiccazione)
- Smontare l'apparato gel e con attenzione rimuovere una lastra di vetro lasciando il gel su l'altro. Tagliare una piccola porzione del gel da appena sopra la banda colorante OrangeG al fondo contenente l'IP 6 standard e una corsia campione, come mostrato nella Figura 1.
- Macchiare la parte tagliata del gel con blu di toluidina (0,1% (w / v) di blu di toluidina, 20% (w / v) metanolo, 2% (w / v) glicerolo) per alcuni minuti (1-3 min) o fino a quando la band pirofosfato inositolo appare. Mettere la lastra di vetro precedentemente rimosso torna in cima al gel per evitare che il gel senza macchia si secchi.
L'IP a 7 bande dovrebbero essere visibili in quanto corre leggermente più lento del IP 6 standard. ATP, che corre più veloce di IP 6, dovrebbero essere visibili (Figura 1). Trasferire la parte macchiata del gel in un de-soluzione colorante (20% (w / v) metanolo) per alcuni minuti, lavare via ogni eccesso di blu di toluidina e riposizionare il gel con il gel senza macchia.
Se la visualizzazione di più isoforme pyrophosphorylated inositolo IP (IP 8 e 9) è richiesto, macchia il gel con una soluzione di toluidina colorazione blu per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare via il blu toluidina con la de-soluzione colorante per circa 15 minuti.
- Con una lametta tagliare la banda IP 7 sulla porzione senza macchia del gel utilizzando come riferimento la posizione di migrazione IP 7 determinato con il gel colorato (Figura 1).
- Mettere la IP 7 band che è stata tagliata dal gel su un tubo da 15 ml e aggiungere 10 ml di MilliQ DDH 2 O. Mettere tubi in rotazione per 10 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il liquido per rimuovere l'eccesso di particelle di acrilammide TBE e microscopiche.
- Successivamente, eseguire due cicli di idratazione-disidratazione. Aggiungere 5 ml di 50% (w / v) metanolo al tubo con il gel contenente 7 IP e ruotare a temperatura ambiente per 2 ore. Trasferire la fetta gel a un nuovo tubo di 15 ml contenente 5 ml di MilliQ DDH 2 O e ruotare a temperatura ambiente per 2 ore. Non eliminare il metanolo e MilliQ H 2 O dai tubi. Ripetere la disidratazione-idratazione ciclo ancora una volta da ri-trasferimento del gel di poliacrilammide in provette da 15 ml precedentemente utilizzato. Uno dei lavaggi può essere eseguita durante la notte.
- Per concentrare l'IP eluiti 7, asciugare il 10 mL insieme (5 ml MilliQddH 2 O e 5 ml al 50% (w / v) metanolo) utilizzando un SpeedVac riscaldata a 60 ° C.
- Una volta che i campioni sono quasi a secco, trasferire il liquido residuo (300-600 mL) a A1.5 tubo ml centrifuga e gira per 2 minuti a 5000 rpm.
- Raccogliere il supernatante e trasferirlo in un nuovo tubo di 1,5 ml per centrifuga; lasciareil fondo 20-30 microlitri dal momento che può contenere particelle di acrilammide.
- Se necessario continuare il processo di essiccazione mediante un SpeedVac riscaldata. Il recupero di IP 7 è drasticamente ridotto, se i campioni asciugare completamente, quindi terminare il processo di essiccazione, quando i campioni di raggiungere il volume di 100-300 microlitri.
4. Determinazione della IP 7 concentrazione e purezza.
- Utilizzare 2-5 microlitri della recuperato IP 7 campioni per l'esecuzione su un gel PAGE, in modo simile a Sezioni 2,2-2,5. Carico di diluizioni diverse di IP 6 (ovvero 0,5, 1, 2, 4 nmol) come standard la concentrazione e 4 nmol di Poly-P marcatore. Dopo aver eseguito il gel, visualizzare le isoforme pirofosfato inositolo dalla colorazione e de-colorazione il gel intero con una soluzione blu di toluidina, seguendo la procedura descritta al punto 3.2 (Figura 2A).
- Dopo la colorazione toluidina, la concentrazione può essere determinata attraverso la scansione il gel e confrontando le differenze di intensità tra i 6 IP e IP 7, utilizzando software di imaging come immagine-J, come mostrato nella figura 2B.
5. Rappresentante dei risultati:
La conversione preparativa enzimatica di IP da 6 a 7 utilizzando IP IP enzimi 6 K1 e VIP1 può essere facilmente risolto utilizzando l'analisi PAGE (Figura 1). Il carico di 6 IP come controllare le dimensioni con colorazione blu toluidina gel permette l'identificazione dei derivati pyrophosphorylated, dal momento che corrono più lentamente a seconda del numero di gruppi fosfato presenti sull'anello inositolo. La procedura descritta sopra permette la purificazione facile IP 7. L'analisi del pirofosfato purificata da PAGE inositolo ha rivelato la purezza del nostro IP 7 (Figura 2A). È interessante notare che i 5 isomero 1/3PP-IP di IP 7 prodotti di VIP1 migra leggermente più lento del 5PP-IP 5 isomero di IP 7 che viene generato dal IP 6 K1. L'uso di IP 6 standard consentire una facile quantificazione della concentrazione della IP purificato 7 (Figura 2B). Prima di utilizzare 7 IP per ulteriori esperimenti, la sua attività biologica può essere valutata
(Figura 3). 5PP-IP 5 è incubato con VIP1 e con l'IP 7 fosfatasi DDP1 (phosphohydrolase polifosfato diphosphoinositol). Di routine, l'IP purificata 7 è convertito in IP 8 da VIP1 e IP 6 da DDP1 (Figura 3).
Figura 1:. Colorazione di toluidina PAGE e isolamento della banda IP 7 La porzione del gel contenente lo standard IP (6) è stato tagliato e colorati con una soluzione di blu di toluidina. Le tre bande rappresentano (dall'alto in basso) 7 IP, IP 6 e ATP. La parte macchiata del gel è stato quindi allineato con il restante del gel. Questo permette la localizzazione della porzione del gel contenente 7 IP, che possono poi essere tagliato e purificato (casella tratteggiata).
Figura 2: analisi PAGE di IP prodotti di reazione 6 K1 e VIP1. A) Analisi di IP 6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) dalla colorazione blu di toluidina è stato utilizzato per determinare la concentrazione IP 7 purificato da entrambe le 6 di IP K1 (5PP-IP 5) e VIP1 (1/3PP-IP 5) reazioni. B) appezzamento di analisi a dispersione per determinare la concentrazione di IP purificato 7. Le concentrazioni sono state determinate in funzione dell'intensità delle bande, calcolato utilizzando il software ImageJ, rispetto ai livelli pre-determinata quantità di IP 6. L'asse X rappresenta l'intensità, l'asse Y rappresenta concentrazioni espresse in nmol.
Figura 3:. Analisi di IP 7 attività biologica Per determinare la qualità della PI purificata 7 abbiamo incubato 5PP-IP 5 (IP 6 K1 generato IP 7) con VIP1 o con l'IP 7 fosfatasi DDP1 e poi risolto la reazione PAGINA. La colorazione DAPI e toluidina rivelato la produzione prevista di IP 8 da VIP1 e la conversione di IP da 7 a 6 per DDP1 IP.
Discussion
L'uso di inositolo pirofosfato in biochimica è severamente limitato dalla indisponibilità commerciale di tali composti e la scarsa sensibilità dei metodi di rilevazione già esistenti. La combinazione di pagina, che consente la separazione di molecole in possesso di diverso numero di gruppi fosfato e blu di toluidina (Figura 1), un colorante metacromatica che si lega ai gruppi fosfato, consente la facile individuazione delle isoforme pyrophoshate inositolo aprendo nuove vie di ricerca 20.
L'uso della tecnologia descritta PAGE per purificare i prodotti pirofosfato inositolo della reazione enzimatica svolta outby sia IP 6 K1 o VIP1 è un metodo semplice, economico e affidabile che consente la produzione di grandi quantità di IP di alta qualità 7. Il metodo sopra descritto non si limita alla purificazione semplice IP 7, ma piccole modifiche del protocollo descritto può permettere la purificazione di una diversa gamma di pirofosfati inositolo. Superiore fosforilata isoforme pirofosfato inositolo, contenente più di otto gruppi fosfato possono essere rilevati tramite IP 7 o diverse quantità di IP 6 come substrato 20,6. Queste pirofosfati inositolo possono essere rilevati aumentando la lunghezza della procedura di colorazione e successivamente purificato (sezione 3.2). Inoltre, l'uso di IP 5 come substrato per la reazione enzimatica che permette la purificazione di PP-IP 5 e altre pirofosfati inositolo contenente un gruppo idrossile sull'anello inositolo.
In conclusione, questo metodo permette di poco impegnativo per la purificazione affidabile di quantità milligrammo di pirofosfati inositolo con strumenti ampiamente disponibili, aprendo così nuove strade per questo campo di ricerca entusiasmante.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo A. Riccio per gli utili commenti e leggere il manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dal Medical Research Council (MRC) i finanziamenti per l'Unità di Biologia Cellulare e da un Umano Frontier Science Grant Program (RGP0048/2009-C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab | |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Gel apparatus | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 | |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
References
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