Summary
Inositol Pyrophosphate spielen eine wichtige Rolle in der menschlichen Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit, jedoch ist der genaue Wirkungsmechanismus umstritten. Das Fehlen von kommerziell erhältlichen Inosit Pyrophosphate macht detaillierte Studien problematisch. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, zu produzieren und zu isolieren Milligramm Inosit Pyrophosphate.
Abstract
Myo-Inosit kommt in der Natur entweder unverändert oder in komplexer phosphorylierte Derivate. Von den neuesten, sind die beiden häufigsten in eukaryotischen Zellen Inosit pentakisphosphate (IP 5) und Inositol hexakisphosphate (Phytinsäure oder IP 6). IP 5 und IP 6 sind die Vorläufer von Inositol Pyrophosphat-Moleküle, die einen oder mehrere Pyrophosphat-Bindungen 1 enthalten. Die Phosphorylierung von IP 6 erzeugt diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 oder PP-IP 5) und bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 oder (PP) 2-IP 4). Inositol Pyrophosphate wurden aus allen eukaryotischen Organismen so weit untersucht wurde isoliert. Darüber hinaus sind die zwei verschiedene Klassen von Enzymen verantwortlich für Inosit Pyrophosphat-Synthese hoch im Laufe der Evolution 2-4 konserviert.
Die IP 6-Kinasen (IP 6 Ks) besitzen eine enorme katalytische Flexibilität, Konvertieren IP 5 und IP 6 bis PP-IP 4 und IP 7 bzw. und anschließend durch die Verwendung dieser Produkte als Substrate, die Förderung der Erzeugung von komplexen Molekülen 5,6 . Kürzlich wurde eine zweite Klasse von Pyrophosphat erzeugende Enzyme in Form der Hefe-Protein VIP 1 (auch als PP-IP 5 K genannt), die in der Lage, IP 6 bis IP 7 und IP 8 7,8 konvertieren identifiziert wird.
Inositol Pyrophosphate regulieren viele disparate zellulären Prozessen wie Insulinsekretion 9, Telomerlänge 10,11, Chemotaxis 12, vesikuläre Menschenhandel 13, Phosphat-Homöostase 14 und HIV-1 gag Release 15. Zwei Mechanismen der Aktionen haben für diese Klasse von Molekülen, vorgeschlagen worden. Sie können zelluläre Funktion von allosterisch die Interaktion mit bestimmten Proteinen wie AKT 16 beeinflussen. Alternativ kann der Pyrophosphat-Gruppe eine Phosphat vor, phosphorylierter Proteine 17 spenden. Das enorme Potenzial dieses Forschungsgebiets ist durch das Fehlen einer kommerziellen Quelle von Inositol Pyrophosphate, die verhindern, viele Wissenschaftler ist durch das Studium dieser Moleküle und diese neue post-translationale Modifikation behindert. Die derzeit verfügbaren Methoden zur Inositol Pyrophosphate isolieren erfordern anspruchsvolle chromatographische Apparatur 18,19. Diese Verfahren nutzen sauren Bedingungen, die zu Inositol Pyrophosphat Abbau 20 und damit zu einer schlechten Erholung führen kann. Außerdem schränken die umständliche Post-Säule entsalzt Verfahren ihrer Verwendung zu spezialisierten Laboratorien.
In dieser Studie beschreiben wir eine anspruchslose Methode für die Erzeugung, Isolierung und Aufreinigung der Produkte der IP 6-Kinase-und PP-IP 5-Kinasen Reaktionen. Diese Methode wurde von der Fähigkeit der Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) zu lösen hochphosphorylierte Inositol Polyphosphate 20 möglich. Nach IP 6 K1 und PP-IP 5 K enzymatischen Reaktionen mittels IP 6 als Substrat wurde PAGE verwendet, um die erzeugte Inosit Pyrophosphate, die anschließend in Wasser eluiert trennen.
Protocol
1. Enzymatischen Reaktion - Tag 1 (1 Stunde am Nachmittag)
- Der erste Schritt ist zu 10-20 unabhängige enzymatische Reaktionen, in denen IP 6 K1 oder VIP1 konvertieren IP 6, die pyrophosphorylated Isoformen vorzubereiten.
- Wir verwenden His-IP 6 K1 und GST-VIP1 Enzyme aus E. gereinigt coli nach dem Protokoll zuvor beschriebenen 17,18.
- Bereiten Sie 50 ul Reaktionen mit 1x Reaktionspuffer (30 mM Hepes pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM Phosphokreatin (PCr), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg Salz), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 ug His-IP 6 K1 oder GST-VIP1. Anpassen der Lautstärke mit MiliQ ddH 2 O.
- Kurz Spin der Reaktion und bei 37 ° C über Nacht mit einer Rotation.
2. Polyacrylamidgel Gießen und Laden - Tag 2 (4 Stunden am Nachmittag)
- Das Polyacrylamidgel wird hergestellt unter Verwendung von 24 cm lang, 18 cm breit Glasplatten und 1,5 mm breit Abstandshalter. Normalerweise wird ein 16 Lanes oder präparativen einspurige Kamm verwendet wird.
- Bereiten Sie eine Mischung (50 ml / Gel) mit folgendem Inhalt: 35,5% (w / v) Acrylamid: Bisacrylamid 19:1, 1X Tris / Borat / EDTA (TBE), 0,05% (w / v) Ammoniumpersulfat (APS ), TEMED 0,05% (w / v). Gießen Sie die Mischung zwischen dem Pre-gegossenen Glasplatten, den Kamm einsetzen und lassen Sie für 30-60 Minuten bei RT polymerisieren.
- Nachdem das Gel polymerisiert, übertragen Sie die Geräte in den Kühlraum und in 1X TBE für etwa 30-60 Minuten bei 200-300 Volt Vorlauf.
- Add 1X von OrangeG Farbstoff (10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 30% Glycerin, 0,1% OrangeG) zu jeder Reaktion. Bereiten Sie eine Probe mit 2 nmol von IP 6 als Standard-Steuerung laden.
- Wash jede Vertiefung gründlich mit Laufpuffer mit einer Spritze und einer 21G Nadel keinen Niederschlag zu entfernen, dann laden Sie das Gel. Vermeiden Sie das Laden auf der Seite Brunnen.
- Führen Sie das Gel über Nacht bei 450-550 Volt (7 MAMP / Gel), bis die OrangeG Farbstoff Band ist innerhalb der letzten 10 cm vom Boden des Gels.
3. Isolierung von IP 7 - Tag 3 (4 Stunden) und Tag 4 (6-7 Stunden SpeedVac Trocknung)
- Demontieren Sie die Gel-Apparatur und entfernen Sie vorsichtig eine Glasplatte Verlassen des Gels auf die andere. Cut ein kleiner Teil des Gels aus knapp oberhalb der OrangeG Farbstoff-Band an der Unterseite mit der IP-6-Norm und eine Probe Spur, wie in Abbildung 1 dargestellt.
- Stain der Schnitt Teil des Gels mit Toluidinblau (0,1% (w / v) Toluidinblau, 20% (w / v) Methanol, 2% (w / v) Glycerin) für ein paar Minuten (1-3 min) oder bis die Inositol Pyrophosphat-Band erscheint. Legen Sie die Glasplatte vorher wieder an die Spitze des Gels auf die ungefärbten Gel vor dem Austrocknen zu verhindern entfernt.
Die IP-7-Band sollte sichtbar sein, da es etwas langsamer als die IP-6-Norm läuft. ATP, die schneller als IP 6 läuft, sollte auch sichtbar sein (Abbildung 1). Übertragen Sie die gefärbten Teil des Gels in einer de-Färbelösung (20% (w / v) Methanol) für ein paar Minuten, abwaschen Überschuss von Toluidinblau und positionieren das Gel mit dem ungefärbten Gel.
Wenn Visualisierung der höheren pyrophosphorylated Inosit Isoformen (IP 8 und IP 9) erforderlich ist, färben das Gel mit Toluidinblau-Färbelösung für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wäscht das Toluidinblau mit dem de-Färbelösung für ca. 15 Minuten.
- Mit einer Rasierklinge schneiden Sie die IP-7-Band auf dem ungefärbten Teil des Gels, wobei als Referenz die IP 7 migrieren Position mit dem gefärbten Gel (Abbildung 1) bestimmt.
- Legen Sie die IP-7-Band, die aus dem Gel auf eine 15-ml-Tube wurde geschnitten und mit 10 ml MilliQ ddH 2 O. Setzen Sie Rohre in Rotation für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie die Flüssigkeit zu entfernen überschüssige der FSME und mikroskopische Partikel Acrylamid.
- Anschließend führen Sie zwei Dehydration-Hydratation Zyklen. 5 ml 50% (w / v) Methanol in den Schlauch mit dem Gel mit IP 7 und drehen bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Übertragen Sie die Gel-Schicht zu einem neuen 15 ml Röhrchen mit 5 ml MilliQ ddH 2 O und drehen bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Bewahren Sie die Methanol und MilliQ H 2 O aus den Rohren. Wiederholen Sie die Dehydratisierung-Hydratation Zyklus noch einmal durch erneute Übertragung der Polyacrylamidgel in der 15 ml-Röhrchen zuvor verwendet haben. Einer der Waschungen können über Nacht durchgeführt werden.
- Zur Konzentration der eluierten IP 7, trocknen die 10 mL zusammen (5 mL MilliQddH 2 O und 5 ml 50% (w / v) Methanol) mit einem SpeedVac bei 60 ° C erhitzt
- Sobald die Proben fast trocken sind, überweisen Sie die restliche Flüssigkeit (300-600 ul) zu A1.5 mL Zentrifugenröhrchen und Spin für 2 Minuten bei 5000 Umdrehungen pro Minute.
- Sammeln Überstandes und Überführung in ein frisches 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen; verlassenunten 20 bis 30 ul da kann Acrylamid Partikel enthalten.
- Wenn nötig auch weiterhin den Trocknungsprozess mit einem unbeheizten SpeedVac. Die Rückgewinnung von IP 7 drastisch reduziert wird, wenn die Proben vollständig trocken, daher beenden den Trocknungsprozess, wenn die Proben das Volumen von 100-300 ul erreichen.
4. Bestimmung der IP 7 Konzentration und Reinheit.
- Verwenden Sie 2-5 ul der zurückgewonnenen IP 7 Probe auf einer PAGE-Gel laufen, ähnlich wie bei den Abschnitten 2,2-2,5. Legen Sie mehrere Verdünnungen von IP 6 (dh 0,5, 1, 2, 4 nmol) als Konzentration Standard-und 4 nmol Poly-P-Marker. Nach dem Ausführen des Gels, visualisieren die Inositol Pyrophosphat Isoformen durch Färbung und de-Färbung der gesamten Gel mit Toluidinblau-Lösung nach dem Verfahren in Abschnitt 3.2 (Abbildung 2A) beschrieben.
- Nach Toluidine Färbung können die Konzentrationen durch Scannen des Gels und den Vergleich der Unterschiede in der Intensität zwischen IP 6 und IP 7, mit Imaging-Software wie z. B. Image-J, wie in Abbildung 2B gezeigt bestimmt werden.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Die präparative enzymatische Umwandlung von IP 6 bis 7 über IP IP 6 K1 und VIP1 Enzyme können leicht behoben werden mit PAGE-Analyse (Abbildung 1). Das Laden von IP 6 als Steuerung der Größe zusammen mit Toluidinblau Gelfärbung ermöglicht die Identifizierung des pyrophosphorylated Derivate, da sie langsamer, je nach Anzahl der Phosphat-Gruppen an der Inositolring laufen. Das oben beschriebene Verfahren ermöglicht die einfache Reinigung von IP 7. Die Analyse der gereinigten Inosit Pyrophosphat durch PAGE zeigte die Reinheit unserer IP 7 (Abbildung 2A). Interessanterweise wandert der 1/3PP-IP 5 Isomer von IP 7 Produkt VIP1 etwas langsamer als die 5PP-IP 5-Isomer von IP 7, die durch die IP 6 K1 erzeugt wird. Verwendung von IP-6-Normen erlauben eine einfache Quantifizierung der Konzentration des gereinigten IP 7 (Abbildung 2B). Vor der Verwendung IP 7 für weitere Experimente, kann seine biologische Aktivität beurteilt werden
(Abbildung 3). 5PP-IP 5 ist mit VIP1 und mit der IP 7 Phosphatase DDP1 (diphosphoinositol Polyphosphat Phosphohydrolase) inkubiert. Routinemäßig wird das gereinigte IP 7 bis IP 8 von VIP1 und IP 6 von DDP1 (Abbildung 3) umgewandelt.
Abbildung 1:. Toluidine Färbung von PAGE und Isolierung der IP 7-Band-Der Anteil des Gels mit den Standard-(IP 6) wurde geschnitten und gefärbt mit einer Toluidinblau-Lösung. Die drei Bands vertreten (von oben nach unten) IP 7, IP 6 und ATP. Die gefärbten Teil des Gels wurde dann mit den verbleibenden des Gels ausgerichtet. Dies ermöglicht die Lokalisierung der Teil des Gels mit IP 7, die dann geschnitten werden und gereinigt werden (gestrichelter Kasten).
Abbildung 2: PAGE-Analyse von IP 6 K1 und VIP1 Reaktionsprodukte. A) Analyse von IP 6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) mit Toluidinblau-Färbung wurde verwendet, um die IP 7 Konzentration von beiden IP 6 K1 (5PP-IP 5) und VIP1 (1/3PP-IP gereinigt bestimmen 5) Reaktionen. B) Streudiagramm Analyse zur Bestimmung der Konzentration des gereinigten IP 7. Die Konzentrationen wurden nach Bandenintensität, berechnet mit ImageJ-Software im Vergleich zu vorher festgelegten Mengen an IP 6 bestimmt. Die X-Achse stellt Intensitäten, die Y-Achse repräsentiert Konzentrationen in nmol ausgedrückt.
Abbildung 3:. Analyse von IP 7 biologische Aktivität Um die Qualität des gereinigten IP 7 ermitteln wir inkubiert 5PP-IP 5 (IP 6 K1 erzeugten IP 7) mit VIP1 oder mit der IP 7 Phosphatase DDP1 und dann beschlossen die Reaktion auf PAGE. Die DAPI und Toluidine Färbung zeigten die erwarteten Produktion von IP 8 von VIP1 und die Umwandlung von IP 7 bis IP 6 von DDP1.
Discussion
Die Verwendung von Inositol Pyrophosphat in der Biochemie ist stark von der kommerziellen Nichtverfügbarkeit solcher Verbindungen und die geringe Empfindlichkeit des vorhandenen Nachweismethoden begrenzt. Die Kombination von PAGE, die die Trennung von Molekülen, die unterschiedliche Anzahl von Phosphatgruppen, und Toluidinblau (Abbildung 1), einem metachromatischen Farbstoff, der Phosphat-Gruppen bindet, ermöglicht es ermöglicht die einfache Erfassung von Inositol pyrophoshate Isoformen der Eröffnung neuer Wege in der Forschung 20.
Die beschriebene Verwendung von PAGE-Technologie in Inositol Pyrophosphat Produkte der enzymatischen Reaktion zu reinigen durchgeführt outby entweder IP 6 K1 oder VIP1 ist eine einfache, wirtschaftliche und zuverlässige Methode, die für die Herstellung großer Mengen von hoher Qualität IP 7 ermöglicht. Das oben beschriebene Verfahren ist nicht auf die einfache Reinigung von IP 7, aber begrenzte geringfügige Modifikationen der beschriebenen Protokoll kann die Reinigung von einem anderen Bereich von Inositol Pyrophosphate ermöglichen. Höhere phosphorylierte Inosit Pyrophosphat Isoformen, mit mehr als acht Phosphat-Gruppen mehr nachweisbar mit IP 7 oder unterschiedliche Mengen an IP 6 als Substrat 20,6 sein. Diese Inosit Pyrophosphate kann durch Erhöhung der Länge der Färbung und anschließend gereinigt (Abschnitt 3.2) nachgewiesen werden. Außerdem würde die Verwendung von IP 5 als Substrat für die enzymatische Reaktion zu ermöglichen die Reinigung von PP-IP 5 und andere Inosit Pyrophosphate mit einer Hydroxylgruppe am Inositolring.
Im Ergebnis ermöglicht diese anspruchslose Methode für die zuverlässige Reinigung von Milligramm-Mengen von Inositol Pyrophosphate mit weit verfügbaren Instrumente und eröffnet damit neue Wege für dieses spannende Forschungsfeld.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken A. Riccio für hilfreiche Kommentare und das Manuskript zu lesen. Diese Arbeit wurde von der Medical Research Council (MRC) die Finanzierung auf den Cell Biology Unit und durch eine Human Frontier Science Program Grant (RGP0048/2009-C) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab | |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Gel apparatus | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 | |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
References
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