Summary
İnositol pyrophosphates kanser, diyabet ve obezitenin insan patolojilerin önemli bir rol oynar; ancak, etki mekanizması tam bir anlaşmazlık meselesidir. Piyasada bulunan inositol pyrophosphates eksikliği detaylı çalışmalar sorunlu vermektedir. Burada inositol pyrophosphates miligram üretmek ve izole etmek için basit bir protokol.
Abstract
Myo-inositol, doğa ya da değiştirilmemiş veya daha karmaşık fosforile türevleri mevcuttur. Son ki, ökaryotik hücrelerde en bol iki inositol pentakisphosphate (IP 5) ve inositol hexakisphosphate (fitik asit ya da IP 6). IP 5, IP 6, bir ya da daha fazla pirofosfat bağlar 1 içeren inositol pirofosfat moleküllerin habercileri . IP 6 Fosforilasyon diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 veya 5 PP-IP) ve bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 veya (PP) 2-IP 4) üretir. İnositol pyrophosphates şimdiye kadar üzerinde çalışılan bütün ökaryotik organizmalardan izole edilmiştir. Buna ek olarak, iki ayrı sınıflar inositol pirofosfat sentezi için sorumlu enzimlerin yüksek 2-4 evrim boyunca korunmuş.
IP 6 kinazlar (IP 6 Ks) sahip muazzam bir katalitik esneklik, 5 IP ve IP 6, PP-IP 4 ve sırasıyla IP 7 ve daha sonra, substrat olarak bu ürünleri kullanarak, daha karmaşık moleküller nesil 5,6 teşvik dönüştürme . Son zamanlarda, pirofosfat üreten enzimlerin ikinci sınıf bir IP 7 ve IP 8 7,8 6 IP dönüştürmek mümkün maya protein VIP 1 formu (PP-IP 5 K olarak anılacaktır), tespit edilmiştir.
İnositol pyrophosphates insülin salgılanması 9, telomer uzunluğu 10,11, kemotaksi 12, veziküler kaçakçılığı 13, fosfat homeostazı 14 ve HIV-1 gag sürümü 15 gibi birçok farklı hücresel süreçleri düzenler. Moleküllerin bu sınıf için eylem iki mekanizma ileri sürülmüştür. Allosterically AKT 16 gibi spesifik proteinlerin etkileşim hücresel fonksiyonları etkileyebilir. Alternatif olarak, bir fosfat pirofosfat grubu ön fosforile proteinler 17 bağışta bulunabilirsiniz. Bu araştırma alanında büyük bir potansiyel inositol pyrophosphates, pek çok bilim adamı bu moleküller ve bu yeni post-translasyonel değişiklik eğitim engelleyen bir ticari kaynak yokluğunda tarafından engellenmektedir. Inositol pyrophosphates izole etmek için mevcut yöntemleri gelişmiş kromatografi 18,19 gerektirir. Bu prosedürler, inositol pirofosfat bozulması 20 ve böylece kötü kurtarma yol açabilir asidik koşullarda kullanın . Ayrıca, hantal bir post-kolon tuzsuzlaştırma prosedürleri uzman laboratuarlar kullanımını kısıtlamak.
Bu çalışmada, IP, 6-kinaz ve PP-IP 5-kinazlar reaksiyonlar ürünleri üretimi, izolasyon ve saflaştırma için basit bir yöntem tarif . Bu yöntem, yüksek fosforile inositol polifosfatlar çözmek için 20 poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) yeteneği sayesinde mümkün oldu . IP 6 K1 ve yüzey gibi IP 6 kullanarak IP PP-5 K enzimatik reaksiyonların ardından, SAYFA, daha sonra suda yıkandı, oluşturulan inositol pyrophosphates ayırmak için kullanılır oldu.
Protocol
1. Enzimatik Reaksiyon - 1. gün (öğleden sonra 1 saat)
- IP 6 K1 veya VIP1 pyrophosphorylated izoformları IP 6 dönüştürmek 10-20 bağımsız enzimatik reaksiyonları hazırlamak için ilk adım.
- E. gelen arıtılmış Onun IP 6 K1 ve GST-Vip1 enzimler coli protokole göre, daha önce açıklanan 17,18.
- 1X reaksiyon tamponu (pH 6,8 30 mM HEPES, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM phosphocreatine (PCr), 25 U / ml CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg içeren 50 mcL reaksiyonlar hazırlayın tuz), 0.3 mM IP6, 0.05-0.1 mg Onun IP 6 K1 veya GST-Vip1. MiliQ GKD 2 O. ile ses seviyesini ayarlayın
- Kısaca 37 reaksiyon ve inkübe ° C gecede rotasyon ile dönerler.
2. Poliakrilamid jel döküm ve yükleme günlük 2 (öğleden sonra 4 saat)
- Poliakrilamid jel, 24 cm uzunluğunda, 18 cm genişliğinde cam plakalar ve 1.5 mm genişliğinde ayırıcılar kullanılarak hazırlanmıştır. Genellikle 16 şeritli veya preparatif tek şeritli tarak kullanılır.
- % 35.5 (w / v) Akrilamid:: Bis-Akrilamid 19:01, 1X Tris / Borat / EDTA (TBE),% 0,05 (w / v) amonyum persülfat (APS aşağıdaki maddeleri içeren bir karışımı (50 ml / jel) hazırlayın ) 0.05% (w / v) Temed. Ön-döküm cam plakalar arasındaki karışımı dökün tarak yerleştirin ve 30-60 dakika oda sıcaklığında polimerize izin.
- Jel polimerize sonra, soğuk oda cihazın transferi ve 200-300 Volt 30-60 dakika için 1X TBE önceden çalıştırın.
- Her reaksiyon OrangeG boya 1X (10 mM Tris-HCl pH7.0, 1 mM EDTA,% 30 gliserol,% 0,1 OrangeG) ekleyin. Standart bir kontrol olarak yüklemek için IP 6 2 nmol içeren bir örnek hazırlayın.
- Herhangi bir çökelti kaldırmak için bir şırınga ve bir 21G iğne kullanarak tampon çalışan her bir kuyunun iyice yıkayın, sonra jel yükleyin. Yan kuyu yükleme kaçının.
- OrangeG boya grubu, son 10 cm içerisinde jel alttan kadar, 450-550 Volt (7 mAmp / jel) geceleme jel çalıştırın.
3. IP 7 İzolasyon - 3. gün (4 saat) ve günde 4 (6-7 saat SpeedVac kurutma işlemi)
- Jel aygıtı sökün ve bir cam levha diğeri jel bırakarak dikkatlice kaldırın. Şekil 1'de gösterildiği gibi alt IP 6 standart ve bir örnek şerit içeren jel OrangeG boya bant üzerinde sadece küçük bir kısmı, kesin.
- Lekelere kesme Toluidine Blue (% 0,1 (w / v)% 20 (w / v) metanol, toluidin mavi,% 2 (w / v) gliserol) ile bir kaç dakika jel bölümü (1-3 dk) veya inositol pirofosfat grubu görünene kadar. Daha önce boyanmamış jel kurumasını önlemek için jel üstünde kaldırıldı cam plaka koyun.
IP 7 bant IP 6 standart biraz daha yavaş çalışır görünür olmalıdır. ATP, IP 6 daha hızlı çalışır, aynı zamanda görünür olmalıdır (Şekil 1). Transfer jel lekeli kısmı birkaç dakika için de boyama solüsyonu (% 20 (w / v) metanol), Toluidine Blue herhangi bir aşırı yıkayacak ve lekesiz bir jel ile jel yeniden konumlandırmak.
Yüksek pyrophosphorylated inositol izoformları (IP 8 ve IP 9) görselleştirme gerekiyorsa, oda sıcaklığında 20 dakika Toluidine Blue boyama solüsyonu ile jel leke. Daha sonra, yaklaşık 15 dakika için de boyama çözüm Toluidine Blue yıkayın.
- Bir jilet boyanan jel (Şekil 1) ile belirlenen IP 7 göçmen konumu referans olarak kullanarak jel lekesiz bir kısmı IP 7 bant kesilmiş .
- IP 7 band 15 ml tüp jel kesilen koyun ve MilliQ GKD 2 O. 10 ml Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle dönüşümlü olarak tüpler koyun. TBE ve mikroskopik akrilamid parçacıkların aşırı kaldırmak için sıvı atın.
- Daha sonra, iki dehidratasyon hidrasyon döngüleri gerçekleştirin. IP 7 içeren jel ile tüpe 5 ml% 50 (w / v) metanol ekleyin ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında döndürmek. MilliQ GKD 2 O 5 ml içeren yeni bir 15 ml tüp jel dilim transferi ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında döndürmek. Tüplerinden metanol ve MilliQ H 2 O atmayın. Önceden kullanılan 15 ml tüpler yeniden transfer poliakrilamid jel dehidratasyon hidrasyon döngüsü bir kez daha tekrarlayın. Yıkar biri gece boyunca yapılabilir.
- Yıkandı, IP 7 konsantre için 60 ısıtılmış bir SpeedVac ° C ile birlikte 10 ml (5 ml MilliQddH 2 O ve 5 ml% 50 (w / v) metanol), kuru
- Örneklerin neredeyse kuru sonra kalan sıvı (300-600 ul), ± 1.5 ml santrifüj tüp ve 5000 rpm'de 2 dakika spin aktarın.
- 1,5 mL taze bir santrifüj tüpü içine supernatant ve transfer toplayın; terkalt 20-30 mcL akrilamid parçacıklar içerebilir.
- Gerekirse bir ısıtmasız SpeedVac kullanarak kurutma işlemi devam etmektedir. Örnekleri hacmi 100-300 mcL ulaştığınızda örnekleri tamamen kurumasını, IP 7 kurtarma önemli ölçüde azalır, bu nedenle kurutma işlemi sona erdirmek.
4. IP 7 konsantrasyonu ve saflık tayini.
- Bölüm 2.2-2.5 benzer, 2-5 PAGE jel üzerinde çalıştırmak için kurtarılan IP 7 örnek mcL kullanın. , Konsantrasyon standart ve 4 Poly-P marker nmol olarak 6 IP birkaç dilüsyonları (yani 0.5, 1, 2, 4 nmol) yükleyin . Jel çalıştırdıktan sonra, Bölüm 3.2 (Şekil 2A) açıklanan prosedürü izleyerek, boyama ve Toluidine Blue çözüm ile de boyama tüm jel inositol pirofosfat izoformları görselleştirmek.
- Toluidine boyama sonra, konsantrasyonları Şekil 2B gösterildiği gibi, jel, tarama ve IP 6 ve 7 IP arasında yoğunluk farklılıkları karşılaştırarak, Resim-J gibi görüntüleme yazılımı kullanarak tespit edilebilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
IP 6 K1 ve VIP1 enzimler kullanarak IP 7 IP 6 hazırlık enzimatik dönüşüm PAGE analizi (Şekil 1) kullanarak kolayca çözülebilir. Inositol halka üzerinde bulunan fosfat grupları sayısına göre daha yavaş çalışabilir Toluidine Blue jel boyama ile birlikte bir boyut kontrolü gibi IP 6 yükleme, pyrophosphorylated türevleri belirlenmesini sağlar. Yukarıda açıklanan prosedür 7 IP kolay arıtma sağlar. PAGE ile saflaştırılmış inositol pirofosfat analizi bizim IP 7 (Şekil 2A) saflığını ortaya çıkardı. İlginçtir ki, VIP1 IP 7 ürün 1/3PP-IP 5 izomeri IP 6 K1 tarafından oluşturulan IP 7 5PP IP 5 izomeri biraz daha yavaş göç eder. Arındırılmış IP 7 (Şekil 2B) konsantrasyonu kolay bir kantifikasyon izin IP 6 standartlarının kullanın. Daha fazla deneyler için IP 7 kullanmadan önce, biyolojik aktivite tespit edilebilir
(Şekil 3). 5PP IP 5 VIP1 ve IP 7 fosfataz DDP1 (diphosphoinositol polifosfat phosphohydrolase) ile inkübe edilir. Rutin, saflaştırılmış IP 7 DDP1 (Şekil 3) VIP1 tarafından 8 IP ve IP 6 dönüştürülür.
Şekil 1: IP 7 bant ve izolasyon SAYFA Toluidine boyama standart (IP 6) içeren jel kısmı kesilmiş ve Toluidine Blue çözüm kullanılarak boyandı. Üç grup (yukarıdan aşağıya) IP 7, IP 6 ve ATP temsil eder. Jel lekeli kısmı daha sonra kalan jeli ile uyumlu hale getirilmiştir. Bu IP 7, (kesikli kutu) kesilmiş ve temizlenmiş olabilir içeren jel kısmı lokalizasyonu sağlar.
Şekil 2: IP 6 K1 ve VIP1 tepkime ürünleri SAYFA analizi. A) Toluidine Blue boyama ile IP 6 Analiz (4, 2, 1, 0.5 nmol) IP 6 K1 (5PP IP 5) ve VIP1 (1/3PP-IP hem arınmış IP 7 konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan 5) reaksiyonlar. B) Scatter plot analiz saflaştırılmış IP 7 konsantrasyonunu belirlemek için. Konsantrasyonları ImageJ yazılım kullanarak IP 6, önceden belirlenmiş miktarda göre hesaplanan bant yoğunluğu, göre belirlenmiştir. X-ekseni şiddetleri temsil eder; Y ekseni nmol ifade konsantrasyonları temsil eder.
Şekil 3: IP 7 biyolojik aktivite analizi saflaştırılmış IP 7 kalitesini belirlemek için DDP1 VIP1 veya IP 7 fosfataz 5PP IP 5 (IP 6 K1 IP 7) inkübe ve ardından SAYFA reaksiyon çözümlenir. DAPI ve Toluidine boyama VIP1 tarafından 8 IP beklenen üretim ve DDP1 IP 6 ila 7 IP dönüşüm ortaya çıkardı.
Discussion
Biyokimya inositol pirofosfat ciddi bu tür bileşiklerin ticari kullanılamaması ve mevcut algılama yöntemleri kötü hassasiyeti ile sınırlıdır. Farklı fosfat grupları sayısı ve Toluidine Blue (Şekil 1), fosfat grupları bağlanır metakromatik boya, sahip moleküllerin ayrılmasını sağlayan SAYFA kombinasyonu araştırma 20 yeni yollar açılması inositol pyrophoshate izoformları kolay tespit edilmesini sağlar.
Outby yapılan enzimatik reaksiyon inositol pirofosfat ürünler arındırmak için SAYFA teknoloji açıklanan kullanım IP 6 K1 veya VIP1 ya da basit, ekonomik ve güvenilir, yüksek kaliteli IP 7 büyük miktarlarda üretim için izin veren bir yöntemdir . Yukarıda açıklanan yöntem 7 IP basit arıtma sınırlı değil ama açıklanan protokol küçük değişiklikler inositol pyrophosphates farklı bir dizi arıtma izin verebilir. Sekizden fazla fosfat grupları içeren Yüksek fosforile inositol pirofosfat izoformları, IP IP 6, 7 veya farklı miktarlarda bir substrat 20,6 olarak tespit edilebilir. Bu inositol pyrophosphates boyama prosedürünü uzunluğunun artırılması ve daha sonra saflaştırılmış (bölüm 3.2) tespit edilebilir. Ayrıca, IP 5 enzimatik reaksiyon için substrat olarak kullanımı 5 PP-IP arıtma ve inositol halka bir hidroksil grubu içeren diğer inositol pyrophosphates izin verecek.
Sonuç olarak, bu basit yöntem, böylece, bu heyecan verici araştırma alanı için yeni yollar açılması, yaygın kullanılan enstrümanlar ile inositol pyrophosphates miligram miktarda güvenilir arıtma sağlar.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
A. Riccio yararlı yorumlar için teşekkür ediyor ve el yazması okumak için. Bu çalışma Hücre Biyolojisi Birimi Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) finansman ve İnsan Frontier Bilim Programı Hibe (RGP0048/2009-C) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab | |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Gel apparatus | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 | |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
References
- Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling. Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).
- Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. Are inositol pyrophosphates signalling molecules? J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).
- Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function. Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).
- Shears, S. B.
- Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases. Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).
- Draskovic, P. Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups. Chem Biol. 15, 274-286 (2008).
- Mulugu, S. A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate. Science. 316, 106-109 (2007).
- Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases. J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).
- Illies, C. Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells. Science. 318, 1299-1302 (2007).
- Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).
- York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. Inositol diphosphate signaling regulates telomere length. J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).
- Luo, H. R. Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions. Cell. 114, 559-572 (2003).
- Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).
- Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).
- Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).
- Bhandari, R. Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).
- Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1). Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).
- Otto, J. C. Biochemical analysis of inositol phosphate kinases. Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).
- Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).
