Summary
Pyrophosphates Inositol jouer un rôle important dans les pathologies humaines telles le cancer, le diabète et l'obésité; cependant, le mécanisme d'action exact est un sujet de litige. Le manque de commerce pyrophosphates inositol rend études détaillées problématique. Nous décrivons ici un protocole simple de produire et d'isoler milligrammes de pyrophosphates inositol.
Abstract
Myo-inositol est présent dans la nature soit intact ou en plus complexes dérivés phosphorylés. De la dernière, les deux plus abondants dans les cellules eucaryotes sont pentakisphosphate inositol (IP 5) et hexakisphosphate inositol (acide phytique ou IP 6). IP 5 et 6 du protocole IP sont les précurseurs des molécules qui contiennent pyrophosphate inositol une ou plusieurs liaisons pyrophosphates 1. La phosphorylation de propriété intellectuelle génère six diphoshoinositolpentakisphosphate IP (7 ou PP-PI 5) et bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate IP (8 ou (PP) 2-IP 4). Pyrophosphates inositol ont été isolées de tous les organismes eucaryotes étudiées jusqu'ici. En outre, les deux classes distinctes d'enzymes responsables de la synthèse du pyrophosphate inositol sont très conservés au cours de l'évolution 2-4.
Le 6 IP kinases (IP 6 Ks) possèdent une énorme flexibilité catalytique, la conversion IP et IP 5 6 PP-PI 4 et 7, respectivement IP et ensuite, en utilisant ces produits comme substrats, promouvoir la production de molécules plus complexes 5,6 . Récemment, une deuxième classe d'enzymes générant pyrophosphate a été identifié dans la forme de la protéine de levure VIP 1 (aussi appelé le PP-PI 5 K), qui est capable de convertir IP à IP 6 7 8 7,8 et IP.
Pyrophosphates Inositol réguler de nombreux processus cellulaires disparates tels que 9 sécrétion d'insuline, la longueur des télomères 10,11, 12 chimiotactisme, le trafic vésiculaire 13, 14 homéostasie du phosphate et du VIH-1 gag communiqué 15. Deux mécanismes d'actions ont été proposées pour cette classe de molécules. Ils peuvent affecter la fonction cellulaire par allostériquement interagissant avec des protéines spécifiques comme AKT 16. Alternativement, le groupe pyrophosphate pouvez faire un don d'un phosphate de pré-phosphorylée protéines 17. L'énorme potentiel de ce domaine de recherche est entravée par l'absence d'une source commerciale de pyrophosphates inositol, qui empêche de nombreux scientifiques de l'étude de ces molécules et cette nouvelle modification post-traductionnelle. Les méthodes actuellement disponibles pour isoler les pyrophosphates inositol nécessitent sophistiqués appareil chromatographique 18,19. Ces procédures utilisent des conditions acides qui pourraient conduire à la dégradation de l'inositol pyrophosphate 20 et donc à une mauvaise récupération. Par ailleurs, la lourdeur des procédures dessalage post-colonne de restreindre leur utilisation à des laboratoires spécialisés.
Dans cette étude, nous décrivons une méthode peu exigeante pour la génération, l'isolement et la purification des produits de l'IP 6-kinase et PP-PI-5 kinases réactions. Cette méthode a été possible par la capacité de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) pour résoudre hautement phosphorylée polyphosphates inositol 20. Suite à IP 6 K1 et PP-PI 5 réactions enzymatiques en utilisant K 6 IP comme substrat, PAGE a été utilisé pour séparer les pyrophosphates généré inositol qui ont été ensuite élue à l'eau.
Protocol
1. Réaction enzymatique - jour 1 (1 heure dans l'après-midi)
- La première étape est de préparer les 10-20 indépendante réactions enzymatiques dans lesquels IP 6 K1 ou VIP1 conversion IP de 6 à isoformes pyrophosphorylated.
- Nous utilisons Sa-IP 6 K1 et TPS-VIP1 enzymes purifiées à partir de E. coli selon le protocole décrit précédemment 17,18.
- Préparer 50 réactions ul contenant 1X tampon de réaction (30 mM Hepes pH 6,8, NaCl 50 mM, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 Phosphocréatine mM (PCR), 25 U / ml CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM d'ATP (Mg sel), 0,3 mM IP6, 0,05 à 0,1 mg Sa-IP 6 K1 ou GST-VIP1. Régler le volume avec MiliQ ddH 2 O.
- Centrifuger brièvement la réaction et incuber à 37 ° C pendant la nuit avec la rotation.
2. Coulée de gel de polyacrylamide et chargement - jour 2 (4 heures dans l'après-midi)
- Le gel de polyacrylamide est préparé à partir de 24 cm de long, 18 cm de plaques de verre de large et 1,5 mm entretoises large. Habituellement une ruelle ou d'un peigne 16 préparative seule voie est utilisée.
- Préparer un mélange (50 ml / gel) contenant les éléments suivants: 35,5% (p / v) d'acrylamide: bis-acrylamide 19h01, le persulfate d'ammonium 1X Tris / borate / EDTA (TBE), 0,05% (p / v) (APS ), 0,05% (p / v) Temed. Verser le mélange entre les plaques pré-moulé en verre, insérez le peigne et laisser polymériser pendant 30-60 minutes à température ambiante.
- Une fois le gel polymérisé, le transfert à l'appareil de la chambre froide et pré-run en TBE 1X pendant environ 30-60 minutes à 200-300 volts.
- Ajouter 1X de OrangeG colorant (10 mM Tris-HCl pH 7,0, EDTA 1 mM, glycérol 30%, 0,1% OrangeG) pour chaque réaction. Préparer un échantillon contenant 2 nmol d'IP 6 à charger comme un contrôle standard.
- Laver chaque puits abondamment avec de tampon en utilisant une seringue et une aiguille 21G de supprimer tout précipité, puis de charger le gel. Évitez de charger sur le puits côté.
- Exécutez le gel de nuit à 450-550 volts (7 mAmp / gel), jusqu'à ce que la bande de teinture OrangeG est dans les 10 derniers cm du bas du gel.
3. Isolement de la PI 7 - 3 jours (4 heures) et 4 jours (6-7 heures de séchage processus SpeedVac)
- Démonter l'appareil de gel et soigneusement enlever une plaque de verre laissant le gel sur l'autre. Couper une petite portion du gel de la bande juste au-dessus de teinture OrangeG au fond contenant l'adresse IP standard de 6 et une voie de l'échantillon, comme le montre la figure 1.
- Tache la partie découpée du gel au bleu de toluidine (0,1% (p / v) bleu de toluidine, 20% (p / v) méthanol, 2% (p / v) glycérol) pendant quelques minutes (1-3 min) ou jusqu'à ce que la bande de pyrophosphate inositol apparaît. Mettez la plaque de verre préalablement retiré de retour au sommet du gel pour éviter le gel sans tache de sécher.
L'IP 7 bandes devraient être visibles, car il tourne légèrement plus lent que l'adresse IP standard de 6. ATP, qui court plus vite que 6 IP, doit également être visible (figure 1). Transférer la partie colorée du gel dans une solution de-coloration (20% (p / v) méthanol) pendant quelques minutes, laver tout excès de bleu de toluidine et de repositionner le gel avec le gel non colorées.
Si la visualisation de la hausse des isoformes pyrophosphorylated inositol (IP 8 et 9 IP) est nécessaire, aux taches le gel avec une solution de toluidine coloration bleue pendant 20 minutes à température ambiante. Par la suite, laver les bleu de toluidine avec la solution de-coloration pour environ 15 minutes.
- Avec une lame de rasoir couper la propriété intellectuelle 7 bandes sur la partie non colorée du gel en utilisant comme référence la position de la migration IP 7 déterminée avec le gel coloré (figure 1).
- Mettez l'adresse IP 7 bandes qui a été coupé à partir du gel sur un tube de 15 ml et ajouter 10 ml de MilliQ ddH 2 O. Mettez les tubes en rotation pendant 10 minutes à température ambiante. Jeter le liquide pour enlever l'excès de particules d'acrylamide TBE et microscopiques.
- Par la suite, effectuer deux cycles de déshydratation-hydratation. Ajouter 5 ml de 50% (p / v) méthanol pour le tube avec le gel contenant 7 IP et tournent à température ambiante pendant 2 heures. Transférer la tranche de gel d'un nouveau tube de 15 ml contenant 5 ml de MilliQ ddH O 2 et tournent à température ambiante pendant 2 heures. Ne jetez pas le méthanol et l'H 2 O MilliQ des tubes. Répétez le cycle de déshydratation-hydratation fois de plus en re-transférer le gel de polyacrylamide en tubes de 15 ml préalablement utilisés. Un des lavages peuvent être effectués pendant la nuit.
- Pour concentrer la propriété intellectuelle élué 7, sec les 10 mL ensemble (5 ml MilliQddH 2 O et 5 ml à 50% (p / v) méthanol) en utilisant un SpeedVac chauffé à 60 ° C.
- Une fois les échantillons sont presque à sec, le transfert du liquide restant (300-600 ul) à A1.5 tube à centrifuger mL et de spin 2 minutes à 5000 rpm.
- Recueillir le surnageant et transférer dans un nouveau tube de 1,5 ml centrifugeuse, laisserle bas de 20 à 30 uL car il peut contenir des particules d'acrylamide.
- Si nécessaire de poursuivre le processus de séchage en utilisant un SpeedVac non chauffés. La reprise de la PI 7 est considérablement réduit si les échantillons sécher complètement, donc fin du processus de séchage, lorsque les échantillons atteindre le volume de 100-300 mL.
4. Détermination de la PI 7 concentration et la pureté.
- Utilisez 2-5 uL de la propriété intellectuelle 7 échantillon récupéré à courir sur un gel PAGE, similaire aux sections 2.2 à 2.5. Chargez plusieurs dilutions de IP 6 (soit 0,5, 1, 2, 4 nmol) comme standard de concentration et de 4 nmol de poly-P marqueur. Après l'exécution du gel, de visualiser les isoformes pyrophosphate inositol par coloration et de-coloration du gel complet avec Toluidine solution bleue, suivant la procédure décrite à la section 3.2 (figure 2A).
- Après coloration de toluidine, les concentrations peuvent être déterminées en analysant le gel et la comparaison des différences d'intensité entre 6 IP et IP 7, en utilisant un logiciel d'imagerie telles que Image-J, comme le montre la figure 2B.
5. Les résultats représentatifs:
La conversion enzymatique préparative de la PI de 6 à 7 IP utilisant le protocole IP enzymes 6 K1 et VIP1 peut être facilement résolu en utilisant l'analyse PAGE (figure 1). Le chargement de 6 IP comme un contrôle de taille avec coloration gel bleu de toluidine permet l'identification des dérivés pyrophosphorylated, car ils courent plus lentement en fonction du nombre de groupes phosphates présents sur le cycle inositol. La procédure décrite ci-dessus permet la purification facile de 7 IP. L'analyse de la pyrophosphate purifiée inositol par PAGE a révélé la pureté de notre IP 7 (figure 2A). Fait intéressant, le 1/3PP-IP 5 isomère de l'IP 7 produit des VIP1 migre légèrement plus lent que l'5PP-IP 5 isomère de 7 IP qui est généré par la propriété intellectuelle 6 K1. L'utilisation de IP 6 normes permettent une quantification facile de la concentration de l'IP purifiée 7 (figure 2B). Avant d'utiliser 7 IP pour d'autres expériences, son activité biologique peut être évaluée
(Figure 3). 5PP-IP 5 est incubée avec VIP1 et avec l'IP 7 phosphatase DDP1 (phosphohydrolase polyphosphate diphosphoinositol). Régulièrement, l'IP purifiée 7 est converti en IP 8 par VIP1 et à IP 6 par DDP1 (figure 3).
Figure 1:. Coloration Toluidine du PAGE et l'isolement de l'IP 7 bandes La portion du gel contenant le standard IP (6) a été coupées et colorées avec une solution de bleu de toluidine. Les trois bandes représentent (de haut en bas) IP 7, IP 6 et ATP. La partie colorée du gel a été ensuite aligné avec le reste du gel. Cela permet la localisation de la portion du gel contenant 7 IP, qui peut ensuite être coupé et purifié (zone en pointillés).
Figure 2: Analyse de la PI PAGE produits de réaction 6 K1 et VIP1. A) Analyse de la propriété intellectuelle 6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) par coloration au bleu de toluidine a été utilisée afin de déterminer la concentration de propriété intellectuelle 7 purifiés à partir de deux 6 IP K1 (5PP-IP 5) et VIP1 (1/3PP-IP 5) les réactions. B) Analyse Nuage de points pour déterminer la concentration de l'IP purifiée 7. Les concentrations ont été déterminées en fonction de l'intensité des bandes, calculé en utilisant le logiciel ImageJ, par rapport à des quantités prédéterminées de 6 IP. L'axe X représente les intensités; l'axe Y représente la concentration exprimée en nmoles.
Figure 3:. Analyse de l'activité biologique IP 7 Pour déterminer la qualité de l'IP purifiée 7 nous avons incubé 5PP-IP 5 (6 K1 IP IP généré 7) avec VIP1 ou avec l'IP 7 phosphatase DDP1 puis la réaction résolue sur la page. La coloration DAPI et Toluidine révélé la production attendue de 8 IP par VIP1 et la conversion de IP à IP 7 6 par DDP1.
Discussion
L'utilisation de pyrophosphate inositol en biochimie est sévèrement limitée par l'indisponibilité commerciale de ces composés et la faible sensibilité des méthodes de détection existantes. La combinaison de la page, qui permet la séparation de molécules possédant un nombre différent de groupes phosphate, et bleu de toluidine (figure 1), un colorant métachromatique qui se lie à des groupes phosphate, permet la détection facile des isoformes pyrophoshate inositol ouvrir de nouvelles avenues de recherche 20.
L'utilisation de la technologie décrite PAGE pour purifier les produits pyrophosphate inositol de la réaction enzymatique réalisée outby soit 6 IP K1 ou VIP1 est une méthode simple, économique et fiable qui permet la production de grandes quantités d'IP de haute qualité 7. La méthode décrite ci-dessus n'est pas limitée à la simple purification de la PI 7, mais de légères modifications du protocole décrit peut permettre la purification d'une gamme différente de pyrophosphates inositol. Supérieur phosphorylée isoformes pyrophosphate inositol, contenant plus de huit groupes de phosphate peuvent être détectées en utilisant l'IP 7 ou différents montants de 6 IP comme substrat 20,6. Ces pyrophosphates inositol peut être détecté en augmentant la longueur de la procédure de coloration et ensuite purifié (section 3.2). Par ailleurs, l'utilisation de 5 IP comme substrat pour la réaction enzymatique permettant la purification de la PP-PI 5 et d'autres pyrophosphates inositol contenant un groupe hydroxyle sur le cycle inositol.
En conclusion, cette méthode permet peu exigeante pour la purification de quantités fiables milligramme de pyrophosphates inositol avec des instruments largement disponibles, ouvrant ainsi de nouvelles avenues pour ce domaine de recherche passionnant.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions A. Riccio pour leurs commentaires et de lire le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Medical Research Council (MRC) de financement à l'Unité de Biologie cellulaire et par un homme Frontier Science Program Grant (RGP0048/2009-C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab | |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Gel apparatus | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 | |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
References
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