Summary
Инозитол пирофосфаты играют важную роль в человеческой патологии, такие рака, диабета и ожирения, однако точный механизм действия является предметом спора. Отсутствие коммерчески доступных инозитол пирофосфаты предоставляет детальные исследования проблематично. Здесь мы опишем простой протокол для производства и изолировать мг инозитол пирофосфаты.
Protocol
1. Ферментативной реакции - день 1 (1 час в день)
- Первый шаг заключается в подготовке 10-20 независимых ферментативных реакций, в которых ИП 6 K1 или VIP1 преобразования IP 6 до pyrophosphorylated изоформ.
- Мы используем его IP-6 К1 и GST-VIP1 ферментов, очищенный от E. палочки в соответствии с протоколом описано выше 17,18.
- Подготовка 50 мкл реакции, содержащие 1X реакционного буфера (30 мМ Hepes рН 6,8, 50 мМ NaCl, 6 мМ MgSO 4, 1 мМ DTT), 6 мм фосфокреатина (ПЦР), 25 ед / мл CreatinePhosphoKinase (КФК), 5 мМ АТФ (Mg соли), 0,3 мМ IP6, 0,05-0,1 мкг Его-IP 6 K1 или GST-VIP1. Регулировка громкости с MiliQ DDH 2 O.
- Кратко спина реакции и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи с вращением.
2. Полиакриламидном геле литья и погрузка - 2-й день (4 часа в день)
- Полиакриламидном геле подготовлен с использованием 24 см в длину, 18 см шириной пластин стекла и 1,5 мм шириной прокладки. Обычно 16 полосы или препаративной одной гребенкой переулок используется.
- Подготовка смеси (50 мл / гель), содержащий следующие: 35,5% (м / о) акриламид: бис-акриламид 19:1, 1X Трис / Борат / EDTA (КЭ), 0,05% (м / о) персульфата аммония (APS ), 0,05% (м / о) Temed. Вылейте смесь предварительно литых стеклянных пластин, вставьте расческу и пусть полимеризоваться в течение 30-60 минут при комнатной температуре.
- Как только гель полимеризуется, передачу аппарата для холодной комнате и предварительно запустить в 1X TBE около 30-60 минут при 200-300 вольт.
- Добавить 1X из OrangeG красителя (10 мМ Трис-HCl pH7.0, 1 мМ ЭДТА, 30% глицерина, 0,1% OrangeG) для каждой реакции. Подготовка образцов, содержащих 2 нмоль ИП 6 для загрузки в качестве стандартного контроля.
- Промыть каждую лунку тщательно проточной буфера с помощью шприца и иглы 21G, чтобы удалить осадок, а затем загрузить геля. Избегайте нагрузки на стороне скважин.
- Выполнить геля в течение ночи при 450-550 Вольт (7 MAMP / гель), пока OrangeG группы красителя в течение последних 10 см от нижней части геля.
3. Выделение IP-7 - день 3 (4 часа) и 4-й день (6-7 часа SpeedVac процесса сушки)
- Разберите гель аппарата и аккуратно удалить одну стеклянную пластину оставив гель на другую. Cut небольшая часть геля от чуть выше OrangeG группы красителя на дно содержащие ИП 6 стандартных и один образец полосы, как показано на рисунке 1.
- Пятно вырезать часть геля толуидиновым синим (0,1% (м / о) толуидиновым синим, 20% (м / о) метанола, 2% (вес / объем) глицерин) в течение нескольких минут (1-3 мин) или до инозитол группы пирофосфат появляется. Поместите стеклянную пластинку ранее удалили обратно поверх геля для предотвращения неокрашенных гель от высыхания.
ИП 7 полоса должна быть видна, поскольку она работает немного медленнее, чем ИП 6 стандарта. АТФ, который работает быстрее, чем IP-6, также должны быть видны (рис. 1). Передача окрашенные части геля в де-красящим раствором (20% (м / о) метанол) в течение нескольких минут, смыть любое превышение толуидиновым синим и переместить гель с неокрашенными геля.
Если визуализация выше pyrophosphorylated инозитол изоформ (IP-8 и IP-9) не требуется, пятно гель с Толуидин решение окрашивания синий в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем смыть толуидин синий с де-красящим раствором в течение приблизительно 15 минут.
- С лезвием бритвы вырезать IP 7-ми полосный на неокрашенных часть геля, используя в качестве ссылки ИП 7 миграции положение определяется с окрашенных гель (рис. 1).
- Положите ИП 7 группа, которая была вырезана из геля на 15 мл трубки и добавить 10 мл MilliQ DDH 2 O. Положите труб в ротации в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалите жидкость для удаления избытка КЭ и микроскопических частиц акриламида.
- Впоследствии, выполняют две дегидратации-гидратации циклов. Добавьте 5 мл 50% (м / о) метанола в трубку с гелем, содержащим IP-7 и вращаются при комнатной температуре в течение 2 часов. Передача геля для новых 15 мл пробирку, содержащую 5 мл MilliQ DDH 2 O и вращаться при комнатной температуре в течение 2 часов. Не выбрасывайте метанола и MilliQ H 2 O из труб. Повторите дегидратации-гидратации цикл еще раз, повторно передачи полиакриламидном геле в 15 мл трубы использовались ранее. Один из моющие средства могут быть выполнены в течение ночи.
- Чтобы сосредоточиться элюировали ИП 7, сухой 10 мл вместе (5 мл MilliQddH 2 O и 5 мл 50% (м / о) метанола) с использованием SpeedVac нагревают при 60 ° C.
- Как только образцы почти сухая, передача оставшейся жидкости (300-600 мкл) к A1.5 мл центрифужную пробирку и спина в течение 2 минут при 5000 оборотах в минуту.
- Сбор супернатант и передачи в свежем 1,5 мл центрифужную пробирку, оставьтенижняя 20-30 мкл, поскольку она может содержать акриламида частиц.
- При необходимости продолжить процесс сушки использованием неотапливаемых SpeedVac. Восстановление ИП 7 значительно сокращается, если образцы полностью высохнуть, поэтому прекращать процесс сушки, когда образцы достигают объема 100-300 мкл.
4. Определение IP 7 концентрации и чистоты.
- Используйте 2-5 мкл восстановленного ИП 7 образца для работы на PAGE гель, как и в разделах 2.2-2.5. Загрузите несколько разведений ИП 6 (0,5 т., 1, 2, 4 нмоль) в стандартной концентрации и 4 нмоль Поли-Р маркером. После запуска гель, визуализировать инозитол изоформ пирофосфат окрашиванием и де-окрашивание весь гель с толуидиновым синим решение, согласно процедуре, описанной в разделе 3.2 (рис. 2А).
- После Толуидин окрашивания, концентрация может быть определена путем сканирования геля и сравнение различий в интенсивности между IP-6 и IP-7 с помощью обработки изображений, такие как изображения-J, как показано на рисунке 2Б.
5. Представитель Результаты:
Препаративного ферментативного превращения IP 6 до 7 с помощью IP-IP ферменты 6 К1 и VIP1 можно легко разрешить с помощью PAGE анализа (рис. 1). Загрузка IP-6, как размер контроля совместно с Толуидин окрашивания геля Синий позволяет идентифицировать pyrophosphorylated производные, так как они работают медленнее, в зависимости от количества фосфатных групп, присутствующих на инозитол кольцо. Процедура, описанная выше, позволяет легко очистки IP 7. Анализ очищенной инозитол пирофосфат за страницей показал чистоту нашего IP-7 (рис. 2а). Интересно, что 1/3PP-IP 5 изомер ИП 7 продуктом VIP1 мигрирует немного медленнее, чем 5PP-IP 5 изомер ИП 7, порожденный IP 6 К1. Использование IP 6 стандартов разрешения легко количественная концентрация очищенного IP-7 (рис. 2Б). Перед использованием IP-7 для дальнейших экспериментов, его биологическая активность может быть оценен
(Рис. 3). 5PP-IP 5 инкубируют с VIP1 и с ИП 7 фосфатазы DDP1 (diphosphoinositol полифосфат phosphohydrolase). Регулярно, очищенный ИП 7 преобразуется в IP-8, VIP1 и ИП 6 по DDP1 (рис. 3).
Рисунок 1:. Толуидин окрашивание СТРАНИЦА и выделение IP-7-ми полосный часть геля, содержащего стандартные (IP-6) был вырезан и окрашивали толуидин синий раствор. Три полосы представляют (сверху вниз) IP-7, ИП 6 и АТФ. Окрашенных часть геля затем выравнивается с остальными геля. Это позволяет локализация часть геля, содержащего IP-7, которые затем можно вырезать и очищенные (пунктирная коробка).
Рисунок 2: СТРАНИЦА анализ IP реакции 6 К1 и VIP1 продукции. ) Анализ IP-6 (4, 2, 1, 0,5 нмоль) по толуидиновым синим окрашивания был использован для того, чтобы определить IP 7 Концентрация очищенного от обоих ИП 6 К1 (5PP-IP 5) и VIP1 (1/3PP-IP 5) реакций. B) анализ Scatter заговор с целью определения концентрации очищенных IP 7. Концентрации определялись по интенсивности полосы, рассчитанной с использованием программного обеспечения ImageJ, по сравнению с заранее определенным количеством IP-6. X-ось представляет интенсивность, Y-ось представляет концентрации выражены в нмоль.
Рисунок 3. Анализ ИП 7 биологическую активность Для определения качества очищенной ИП 7 мы инкубировали 5PP-IP 5 (ИП 6 К1 порожденных IP-7) с VIP1 или с ИП 7 фосфатазы DDP1, а затем решил реакция на странице. DAPI и Толуидин окрашивание показало, ожидается производство IP-8, VIP1 и преобразование IP-7 по IP-6, DDP1.
Discussion
Использование инозитол пирофосфата в биохимии сильно ограничена коммерческой отсутствия таких соединений и низкой чувствительности существующих методов обнаружения. Сочетание PAGE, который позволяет разделение молекул, имеющих разное количество фосфатных групп, и толуидиновым синим (рис. 1), метахроматическая краситель, который связывается с фосфатными группами, позволяет легко обнаружения инозитол изоформ pyrophoshate открывая новые направления исследований 20.
Описано использование технологии СТРАНИЦА, чтобы очистить инозитол продуктов пирофосфат ферментативной реакции осуществляется outby либо ИП 6 K1 или VIP1 это простой, экономичный и надежный метод, который позволяет для производства большого количества высоких IP качества 7. Описанный выше метод не ограничивается простой очистки IP-7, но незначительные изменения описанного протокола может позволить очистки различный диапазон инозитол пирофосфаты. Высшее фосфорилированных инозитол изоформ пирофосфат, содержащие более восьми фосфатные группы могут быть обнаружены с помощью IP-7 или различное количество IP-6 в качестве подложки 20,6. Эти инозитол пирофосфаты могут быть обнаружены путем увеличения длины Процедура окраски, а затем очищенный (раздел 3.2). Более того, использование IP-5 в качестве субстрата для ферментативной реакции позволит очистки PP-IP-5 и других инозитол пирофосфаты содержащие гидроксильные группы по инозитол кольцо.
В заключение этого нетребовательного метод позволяет надежной очистки миллиграмм количествах инозитол пирофосфаты с широко доступных инструментов, тем самым открывая новые перспективы для этой захватывающей области исследований.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим А. Риччио за полезные комментарии и прочитать рукопись. Эта работа была поддержана Советом по медицинским исследованиям (MRC) финансирования в отдел клеточной биологии и по правам пограничной науки Программа Грант (RGP0048/2009-C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab | |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Gel apparatus | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 | |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
References
- Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling. Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).
- Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. Are inositol pyrophosphates signalling molecules? J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).
- Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function. Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).
- Shears, S. B.
- Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases. Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).
- Draskovic, P. Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups. Chem Biol. 15, 274-286 (2008).
- Mulugu, S. A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate. Science. 316, 106-109 (2007).
- Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases. J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).
- Illies, C. Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells. Science. 318, 1299-1302 (2007).
- Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).
- York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. Inositol diphosphate signaling regulates telomere length. J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).
- Luo, H. R. Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions. Cell. 114, 559-572 (2003).
- Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).
- Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).
- Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).
- Bhandari, R. Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).
- Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1). Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).
- Otto, J. C. Biochemical analysis of inositol phosphate kinases. Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).
- Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).
