Summary
אנו להדגים ייצור של המכשיר microfluidic פשוט כי ניתן לשלב עם setups תקן electrophysiology לחשוף משטחים microscale פרוסת המוח באופן מבוקר היטב נוירוטרנסמיטורים שונים.
Abstract
אנחנו הדגימו את ייצור של מכשיר שני ברמה microfluidic כי ניתן לשלב בקלות עם setups electrophysiology הקיים. מכשיר שני ברמת microfluidic הוא מפוברק באמצעות תקן שני שלבים שלילי להתנגד תהליך ליתוגרפיה 1. הרמה הראשונה מכילה microchannels עם כניסת ויציאות שקע בכל קצה. הרמה השנייה מכילה חורים עגולים microscale ממוקם באמצע של אורך ערוץ מרוכז יחד עם רוחב הערוץ. שיטת השאיבה פסיבי משמש משאבת נוזלים מנמל כניסת ליציאת שקע 2. המכשיר microfluidic משולב עם ה-off-המדף לתאי זלוף מאפשרת אינטגרציה חלקה עם ההתקנה electrophysiology. נוזלים הציג את זרימת כניסת יציאות דרך microchannels כלפי יציאות לשקע וגם להימלט דרך הפתחים מעגלי הממוקם על גבי microchannels לאמבטיה של זלוף. כך פני השטח התחתון של המוח פרוסה להציב באמבטיה קאמרית זלוף ומעל המכשיר microfluidic יכולים להיחשף עם נוירוטרנסמיטורים שונים. העובי של המכשיר microscale microfluidic ואת אופי שקוף של החומרים [זכוכית coverslip ו PDMS (polydimethylsiloxane)] השתמשו כדי להפוך את המכשיר microfluidic לאפשר מיקרוסקופיה של הפרוסה המוח. המכשיר microfluidic מאפשרת אפנון (הן במרחב ובזמן) של גירויים כימיים הציג את microenvironments פרוסה המוח.
Protocol
SU-8 עובש ייצור
יחידת הכנה
- האב SU-8 על מצע פרוסות סיליקון מוכן באמצעות שני שלבים סטנדרטי תהליך שלילי להתנגד ליתוגרפיה.
- סימני יישור על פרוסות סיליקון סיליקון מוסרים באמצעות סכין גילוח כמו גובה של מבנים אלה (הממוקמים לאורך השוליים החיצוניים של פרוסות סיליקון) הוא יותר מבנים המכשיר בפועל.
- פרוסות סיליקון הוא ניקה מכן באמצעות אלכוהול איזופרופילי מיובשים בזרם של N 2. עמודי התמיכה עשוי קלטת עם עובי פחות מ מבנה המכשיר הגבוה ביותר להחליף את סימני יישור על ארבעת הצדדים של פרוסות סיליקון.
הערה: אם גובה עמודי התמיכה היא יותר מאשר המבנים התקן הגבוה ביותר, דרך החורים לא נוצרות עובש PDMS. - פרוסות סיליקון מאסטר ממוקמת על פלטה חשמלית בטמפרטורת החדר.
PDMS הכנה פתרון
- ארבעה גרם של פתרון (PDMS) polydimethylsiloxane מוכן על ידי ערבוב יסודי 10 חלקים אלסטומר סיליקון עם חלק 1 של סוכן ריפוי.
הערה: ודא כי שני פתרונות מעורבבים באופן אחיד כדי להשיג תכונות פיזיות דומות ברחבי עובש PDMS. - בועות שנוצרו בתמיסה PDMS במהלך תהליך ערבוב מוסרים באמצעות ייבוש ואקום.
PDMS ציפוי ריפוי
- בועה נטולת הפתרון PDMS היא לוותר לאט על המאסטר SU-8 לוודא כי הבועות לא נוצרות בתהליך מחלק.
- קצה אחד של הסרט לכתוב על שקיפות ממוקם אז על הצלחת חם והניח לאט על הפתרון PDMS באופן שווה להפיץ את PDMS על המאסטר SU-8. כל הבועות שנוצר במהלך תהליך זה צורך להסיר באמצעות בדיקה.
[הערה: אל תרימו את השקיפות כדי למנוע יצירת בועות יותר.] - לוח borofloat ממוקם על גבי גיליון את השקיפות להפעיל לחץ אחיד. לחץ עדין מוחל על פני השטח העליון של מבנים עגולים הגבוה ביותר (הממוקמת באמצע הדרך של אורכי ערוץ ממורכזת לרוחב הערוצים) כגון שיש מינימלית או ללא PDMS דחוקה בין שקיפות לבין משטח SU-8 החוזר מבנים.
- שלושה לוחות borofloat יותר ממוקמים על גבי הכריך פרוסות סיליקון-borofloat לוח להפעיל לחץ קבוע על פני השטח העליון של המבנים פתח עגול לפני ובמהלך תהליך ריפוי.
- הטמפרטורה של הפלטה החשמלית מוגברת אז עד 75 מעלות צלזיוס ו PDMS נירפאים בטמפרטורה זו במשך שעה 1. צלחת חמה מובא לטמפרטורה של 50 ° C.
- לוחות יוסרו השקיפות מוסר בעדינות והותיר אחריו הורים לבין סדין דק PDMS מצופה על גבי זה.
הבנייה של המכשיר microfluidic
הסרת גיליון PDMS ממורה
- הגבול החיצוני של החדר זלוף היא שגולף על הסדין PDMS באמצעות סכין גילוח לאחר יישור יציאות החדר זלוף עם יציאות על הראשי SU-8.
- גיליון PDMS לאחר מכן להסיר בעדינות מן האדון, מושך לאורך הערוצים כדי למנוע קריעה של PDMS. גיליון PDMS מושם על גיליון שקיפות עם משטח רשת microfluidic כלפי מעלה.
- היציאות מפרצון ו לשקע עשויים מכן באמצעות מקדח הפקק.
Bonding גיליון PDMS זכוכית coverslip
- המשטח מליטה הגיליון PDMS (השטח הכולל את רשת microfluidic) ו coverslip זכוכית אז לנקות בעדינות בעזרת נייר דבק 3M, הניח על גיליון של שקיפות, והניח סוף סוף את החדר 2 O פלזמה.
- משטחים מליטה מטופלים בפלזמה 165 וואט במשך 10 s. המשטח פלזמה טיפול של coverslip הזכוכית היא ערובה מיד אל פני השטח פלזמה שטופלו הגיליון PDMS.
הערה: יש להפעיל לחץ עדין על פני הזכוכית כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו בין משטחים מליטה. - אפשר 5 דקות להשיג מליטה טוב בין PDMS וזכוכית. אחרי 5 דקות בעדינות להסיר את השקיפות שעליה גיליון PDMS הושם על תהליך מליטה.
- המכשיר microfluidic ממוקם במערכת החמצן פלזמה לעשות הערוצים הידרופילי. הטיפול נעשה על הפלזמה 165 וואט למשך דקה 1.
שילוב של מכשיר microfluidic קאמרית זלוף
הכנת החדר זלוף
- תא ה-off-המדף זלוף נצטווה, ויציאות כניסת ו לשקע שנקדחו כך שכאשר המכשיר microfluidic ובית הנבחרים מודבקים, היציאות על החדר ואת המכשיר מיושרים. המשטח התחתון של החדר זלוף מצופה PDMS כדי לקבל חותמת הדוק בין החדר לבין המכשיר microfluidic.
- לכתוב על גיליון שקיפות ממוקם על פלטה חשמלית בטמפרטורת החדר.
- פתרון אחד גרם PDMS מוכן בתהליך דומה לזו שתוארה קודם לכן. בועה נטולת הפתרון PDMS לאחר מכן חילק לאט על הדור שקיפות גיליון הימנעות של בועות.
- החדר ממוקם זלוף אז על הפתרון PDMS.
- לוח borofloat ממוקם אז על גבי תא להפעיל לחץ אחיד להשיג ציפוי דק של PDMS על פני השטח התחתון של החדר.
- הטמפרטורה של הפלטה החשמלית מוגברת אז עד 75 מעלות צלזיוס ו PDMS נירפאים בטמפרטורה זו במשך שעה 1.
Bonding של המכשיר microfluidic קאמרית זלוף
- הלוח הוא להסיר את השקיפות מוסר בעדינות משאירים מאחוריהם חדר זלוף ואת מצופה סדין דק PDMS על המשטח התחתון. PDMS רצויות מוסר באמצעות סכין גילוח ו בדיקה קצה חד להסרת PDMS מנמלי גישה.
- המשטח PDMS של המכשיר microfluidic ואת המשטח התחתון PDMS של החדר אז הם לנקות בעדינות בעזרת קלטת 3M, הניח על גיליון של שקיפות, והניח סוף סוף בחדר פלזמה חמצן.
- משטחים מטופלים בפלזמה 165 וואט במשך 10 s. המשטח מצופה PDMS של החדר היא ערובה מיד אל פני השטח PDMS של המכשיר microfluidic.
הערה: יש להפעיל לחץ עדין על פני הזכוכית כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו בין משטחים מליטה. - מיד לפני השימוש, המכשיר ממוקם במערכת החמצן פלזמה לעשות הערוצים הידרופילי. הטיפול נעשה על הפלזמה 165 וואט למשך דקה 1.
חשיפת פרוסות המוח microenvironment neurochemical באמצעות מכשיר microfluidic
- Microchannels הידרופילי של (מכשיר microfluidic) - (תא זלוף) שילוב מלאים תקן ACSF (מלאכותית נוזל השדרה מוחין) פתרון.
- לוותר על טיפות קטנות של פתרון ACSF בנמלי כניסת ולאפשר הפתרון להיות רשעים לתוך הערוצים. הסר את כל הבועות שמאל באמצעות מזרק מנמל המוצא. לוותר על ירידה גדולה של פתרון ACSF בנמל המוצא, כדי לאפשר פסיבי שאיבה של נוזלים מן מפרצון לנמלי המוצא של המכשיר microfluidic.
הערה: יש להקפיד להסיר את כל הבועות מן הערוצים כדי לאפשר זרימה של נוזלים באמצעות שיטת שאיבה פסיבית. - התיקון (המכשיר microfluidic) - (תא זלוף) משולבת במצע רגיל ולתקן את פלטפורמת רגיל מתאם מיקרוסקופ.
- חבר את כניסת תקן לשקע (יניקה) צינורות לתא זלוף זלוף עבור רציפה של הפרוסה המוח עם פתרון ACSF סטנדרטי. הפתרון הוא ACSF aspirated ברציפות עם 95% O2-5% CO 2.
הערה: שנו את המיקום של צינורות היניקה כדי לשמור על רמה קבועה של ACSF באמבטיה של החדר זלוף. - לאחר קאמרית זלוף מתמלא פתרון ACSF, במקום פרוסת מוח בחדר זלוף בעזרת טפטפת. באמצעות בדיקה, מקם את פרוסת המוח מעל פתחים עגולים במכשיר microfluidic. לאחר פרוסה המוח במיקום הרצוי על פתחים עגולים, השתמש עוגן פרוסה כדי לשתק את הפרוסה המוח.
- המכשיר microfluidic כעת ניתן להשתמש כדי לחשוף את פרוסות המוח (להציב בחדר זלוף ועל גבי הרשת microfluidic) כדי נוירוטרנסמיטורים שונים באמצעות פסיבי שאיבה של נוזלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קיימים macroscale או microscale פרוסה המוח לתאי זלוף מוגבלים מבחינת ההחלטה מרחבית שהם מספקים לחשוף את פרוסות המוח עם נוירוטרנסמיטורים. הטכנולוגיה המכשיר microfluidic הפגינו כאן מתגבר על מגבלה זו באמצעות טכניקות פשוטות bioMEMS. זה צפוי כי פשטות בייצור של המכשיר microfluidic ואת הקלות לשלב אותו עם הקיים setups electrophysiology יאפשר יישום נרחב של טכנולוגיית המכשיר הפגינו. ניסויים מעניינים שלא היו אפשריים קודם לכן ניתן לבצע עם המכשיר microfluidic הנוכחי. Microenvironments שונים של פרוסת המוח יכולים להיחשף נוירוטרנסמיטורים שונים בסקלות זמן שונות. מכשיר אב הטיפוס הנוכחי כולל רק ארבעה ערוצים מקבילים פתחים עגולים הממוקמים אחד ליד השני. עם זאת, פריסת בהתקן זה ניתן לשנות בקלות על ידי יישום עיצובים שונים שהיו פתחים של צורות או בגדלים שונים, או microchannels יכול להיות התפתל בצורה שתביא המיקום של הפתחים microenvironments שונים של פרוסות המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים פתוחים שיתופי פעולה לערב את הטכנולוגיה microfluidic המחישו בתחומים שונים של הביולוגיה.
Acknowledgments
המימון ניתן על ידי NIH MH-64611 ו NARSAD פרס החוקר הצעיר. המחברים גם רוצה להכיר אדם Beagley, מארק Dikopf, ובן סמית לקבלת סיוע טכני שלהם.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-26GPL | Tool | Warner Instruments | W2-64-0236 | Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber |
| SHD-26GH/10 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0253 | Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit |
| Plasma Preen-II 862 | Tool | Plasmatic Systems, Inc. | Microwave plasma system | |
| Model P-1 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0277 | Series 20 Plain Platform, Model P-1 |
| SA-NIK | Tool | Warner Instruments | W2-64-0291 | Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK |
| Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid) | Reagent | Exact composition will vary with application |
References
- Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment. Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).
- Walker, G. M., Beebe, D. J. A passive pumping method for microfluidic devices. Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).
