Summary
हम एक सरल microfluidic युक्ति है कि मानक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी setups के साथ एकीकृत किया जा सकता है अलग न्यूरोट्रांसमीटर के लिए एक अच्छी तरह से नियंत्रित तरीके से एक मस्तिष्क टुकड़ा का microscale सतहों बेनकाब के निर्माण प्रदर्शित करता है.
Abstract
हम एक दो स्तर microfluidic डिवाइस है कि आसानी से मौजूदा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी setups के साथ एकीकृत किया जा सकता के निर्माण दिखा दिया है. दो स्तर microfluidic डिवाइस एक दो कदम नकारात्मक विरोध लिथोग्राफी प्रक्रिया एक मानक का उपयोग कर गढ़े है. प्रथम स्तर के प्रत्येक के अंत में Inlet और आउटलेट बंदरगाहों के साथ microchannels हैं. दूसरे स्तर microscale परिपत्र चैनल लंबाई के रास्ते के मध्य में स्थित है और चैनल चौड़ाई के साथ केंद्रित छेद होते हैं. निष्क्रिय पम्पिंग विधि इनलेट पोर्ट से आउटलेट बंदरगाह 2 के लिए तरल पदार्थ पंप करने के लिए प्रयोग किया जाता है. microfluidic युक्ति बंद-the-शेल्फ छिड़काव कक्षों के साथ एकीकृत है और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेटअप के साथ सहज एकीकरण की अनुमति देता है. तरल पदार्थ के आउटलेट बंदरगाहों की ओर microchannels के माध्यम से प्रवेश बंदरगाहों प्रवाह पर शुरू और भी परिपत्र छिड़काव के स्नान में microchannels के शीर्ष पर स्थित के उद्घाटन के माध्यम से बच. इस प्रकार मस्तिष्क छिड़काव कक्ष स्नान में और microfluidic डिवाइस के ऊपर रखा टुकड़ा के नीचे सतह अलग न्यूरोट्रांसमीटर के साथ उजागर किया जा सकता है. microfluidic युक्ति और सामग्री के पारदर्शी प्रकृति के microscale मोटाई [coverslip कांच और PDMS (polydimethylsiloxane)] microfluidic युक्ति बनाने की अनुमति मस्तिष्क टुकड़ा का माइक्रोस्कोपी करने के लिए इस्तेमाल किया. microfluidic युक्ति रासायनिक मस्तिष्क टुकड़ा microenvironments शुरू उत्तेजनाओं के मॉडुलन (स्थानिक और लौकिक दोनों) की अनुमति देता है.
Protocol
SU-8 मोल्ड निर्माण
मास्टर तैयारी
- मास्टर एसयू 8 सिलिकॉन वफ़र सब्सट्रेट पर एक दो कदम मानक नकारात्मक लिथोग्राफी विरोध प्रक्रिया का उपयोग कर तैयार है.
- सिलिकॉन वफ़र पर संरेखण के निशान इन संरचनाओं की ऊंचाई के रूप में एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर हटा रहे हैं (वफ़र के बाहरी परिधि के साथ स्थित है) वास्तविक युक्ति संरचनाओं की तुलना में अधिक है.
- सिलिकॉन वफ़र तो isopropyl शराब का उपयोग करते हुए साफ किया जाता है और 2 एन के एक धारा में सूख. समर्थन टेप के बाहर सबसे ऊंची डिवाइस संरचना से कम मोटाई के साथ बनाया खंभे वफ़र के चार पक्षों पर संरेखण के निशान की जगह.
नोट: यदि समर्थन स्तंभों ऊंचाई सबसे ऊंची युक्ति संरचनाओं से अधिक है, के माध्यम से छेद PDMS सांचे में नहीं गठन कर रहे हैं. - मास्टर सिलिकॉन वफ़र कमरे के तापमान पर एक गर्म थाली पर रखा गया है.
PDMS समाधान तैयारी
- Polydimethylsiloxane समाधान (PDMS) के चार ग्राम अच्छी तरह से इलाज के एजेंट के भाग 1 के साथ सिलिकॉन elastomer के 10 भागों मिश्रण से तैयार है.
नोट: सुनिश्चित करें कि दो समाधान समान मिश्रित कर रहे हैं PDMS मोल्ड भर में इसी तरह की भौतिक गुण प्राप्त करें. - बुलबुले मिश्रण की प्रक्रिया के दौरान PDMS समाधान में उत्पन्न निर्वात desiccator का उपयोग कर हटा रहे हैं.
PDMS कोटिंग और इलाज
- बुलबुला मुक्त PDMS समाधान धीरे धीरे यकीन है कि बुलबुले वितरण प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं बनाने SU आठ मास्टर पर तिरस्कृत है.
- लिखने पर एक पारदर्शिता फिल्म के एक छोर तो गर्म थाली पर रखा गया है और धीरे धीरे PDMS समाधान पर रखा समान रूप से SU-8 मास्टर पर PDMS फैल. कोई भी इस प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न बुलबुले एक जांच का उपयोग कर हटाया जा जरूरत है.
[ध्यान दें: अधिक बुलबुले की पीढ़ी को रोकने के लिए पारदर्शिता लिफ्ट नहीं है.] - Borofloat स्लैब पारदर्शिता वर्दी दबाव लागू चादर के शीर्ष पर रखा गया है. कोमल दबाव सबसे ऊंची परिपत्र संरचनाओं के ऊपर की सतह (चैनल लंबाई के रास्ते के मध्य में स्थित है और चैनलों की चौड़ाई के साथ केन्द्रित) ऐसी है कि वहाँ कम से कम पारदर्शिता और परिपत्र की सु 8-सतह के बीच sandwiched है या नहीं PDMS पर लागू होता है संरचनाओं.
- तीन अधिक borofloat स्लैब सिलिकॉन वफ़र-borofloat स्लैब परिपत्र खोलने संरचनाओं के शीर्ष से पहले सतह पर और इलाज की प्रक्रिया के दौरान निरंतर दबाव लागू करने के लिए सैंडविच के शीर्ष पर रखा जाता है.
- गर्म थाली के तापमान फिर 75 से बढ़ जाती है डिग्री सेल्सियस और PDMS इस तापमान पर 1 घंटे के लिए ठीक है. 50 डिग्री सेल्सियस के तापमान को गर्म थाली लाया जाता है
- स्लैब हटा दिया है और पारदर्शिता धीरे मास्टर और यह की चोटी पर पतली PDMS लेपित पत्रक के पीछे छोड़ने के लिए हटा दिया है.
Microfluidic युक्ति का निर्माण
PDMS पत्रक के मास्टर से हटाया
- छिड़काव चैम्बर की बाहरी सीमा से बाहर PDMS SU-8 मास्टर पर बंदरगाहों के साथ छिड़काव कक्ष पर बंदरगाहों aligning के बाद एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर पत्रक पर खुदी हुई है.
- PDMS चादर फिर धीरे मास्टर से हटा दिया, PDMS की फाड़ रोकने के चैनल की लंबाई के साथ खींच रहा है. PDMS चादर microfluidic नेटवर्क के ऊपर का सामना करना पड़ सतह के साथ एक पारदर्शिता पत्रक पर रखा गया है.
- Inlet और आउटलेट बंदरगाहों तो एक काग बरमा का उपयोग करने के लिए बना रहे हैं.
PDMS पत्रक के गिलास coverslip के लिए संबंध
- PDMS (सतह microfluidic नेटवर्क युक्त) शीट और एक गिलास coverslip के संबंध सतह फिर धीरे से एक 3M स्कॉच टेप का उपयोग कर साफ है, पारदर्शिता का एक पत्रक पर रखा है, और अंततः हे 2 प्लाज्मा चैम्बर में रखा.
- संबंध सतहों 165 एस के लिए 10 वाट प्लाज्मा के साथ व्यवहार कर रहे हैं कांच coverslip प्लाज्मा सतह इलाज तुरंत PDMS पत्रक के प्लाज्मा सतह इलाज के लिए बंधुआ है.
नोट: गिलास सतह पर कोमल दबाव लागू करने के लिए किसी भी हवाई संबंध सतहों के बीच फंस बुलबुले को दूर. - 5 मिनट PDMS और कांच के बीच अच्छे संबंधों को प्राप्त करने के लिए अनुमति दें. 5 मिनट के बाद धीरे पारदर्शिता जिस पर PDMS शीट संबंध प्रक्रिया के लिए रखा गया था हटा दें.
- microfluidic युक्ति ऑक्सीजन प्लाज्मा प्रणाली हाइड्रोफिलिक चैनलों में रखा गया है. प्लाज्मा उपचार 1 मिनट के लिए 165 वाट पर किया जाता है.
Microfluidic युक्ति और छिड़काव चैम्बर की एकता
छिड़काव कक्ष की तैयारी
- एक बंद-the-शेल्फ कक्ष छिड़काव का आदेश दिया था और Inlet और आउटलेट बंदरगाहों drilled थे ताकि जब microfluidic युक्ति और चैम्बर बंधुआ रहे हैं, चैम्बर और डिवाइस पर बंदरगाहों जुड़ रहे हैं. पी छिड़काव कक्ष के नीचे सतह के साथ लेपित हैकक्ष और microfluidic डिवाइस के बीच एक तंग सील प्राप्त करने के लिए डीएमएस.
- पारदर्शिता पत्रक पर लिखने के कमरे के तापमान पर एक गर्म थाली पर रखा गया है.
- एक ग्राम PDMS समाधान पहले बताया है कि इसी तरह की प्रक्रिया में तैयार है. बुलबुला मुक्त PDMS समाधान तो धीरे धीरे पारदर्शिता बुलबुले की चादर से बचने पीढ़ी पर तिरस्कृत है.
- छिड़काव चैम्बर तब PDMS समाधान पर रखा गया है.
- एक borofloat स्लैब तो वर्दी दबाव लागू करने और कक्ष कक्ष के नीचे सतह पर PDMS की एक पतली परत प्राप्त करने के शीर्ष पर रखा गया है.
- गर्म थाली के तापमान फिर 75 से बढ़ जाती है डिग्री सेल्सियस और PDMS इस तापमान पर 1 घंटे के लिए ठीक है.
Microfluidic युक्ति और छिड़काव चैम्बर के संबंध
- स्लैब हटा दिया है और पारदर्शिता धीरे छिड़काव और इसके नीचे की सतह पर पतली PDMS पत्रक लेपित कक्ष के पीछे छोड़ने के लिए हटा दिया है. अवांछित PDMS एक रेजर ब्लेड और PDMS उपयोग बंदरगाहों से हटाने के लिए एक तेज टिप जांच का उपयोग करने के लिए हटा दिया है.
- PDMS सतह microfluidic युक्ति और कक्ष के नीचे PDMS सतह के फिर धीरे से एक 3M टेप का उपयोग कर साफ है, पारदर्शिता का एक पत्रक पर रखा है, और अंत में ऑक्सीजन प्लाज्मा चैम्बर में रखा.
- सतहों 165 एस के लिए 10 वाट प्लाज्मा के साथ इलाज कर रहे हैं चैम्बर के PDMS लेपित सतह तुरंत microfluidic डिवाइस के PDMS सतह को बंधुआ है.
नोट: गिलास सतह पर कोमल दबाव लागू करने के लिए किसी भी हवाई संबंध सतहों के बीच फंस बुलबुले को दूर. - तुरंत का उपयोग करने से पहले, इस उपकरण ऑक्सीजन प्लाज्मा प्रणाली चैनलों हाइड्रोफिलिक बनाने में रखा गया है. प्लाज्मा उपचार 1 मिनट के लिए 165 वाट पर किया जाता है.
Neurochemical microenvironment मस्तिष्क स्लाइसें microfluidic डिवाइस का उपयोग कर उजागर
- (microfluidic डिवाइस) हाइड्रोफिलिक microchannels - (छिड़काव चैम्बर) संयोजन मानक (कृत्रिम सेरेब्रल स्पाइनल द्रव) ACSF समाधान के साथ भर रहे हैं.
- इनलेट बंदरगाहों पर ACSF समाधान के छोटे बूंदों बांटना और समाधान चैनलों में ऊपर दुष्ट हो अनुमति देते हैं. किसी भी आउटलेट बंदरगाह से एक सिरिंज का उपयोग कर छोड़ दिया बुलबुले निकालें. ACSF समाधान के आउटलेट बंदरगाह पर एक बड़ी गिरावट बांटना इनलेट से microfluidic युक्ति की दुकान बंदरगाहों को निष्क्रिय तरल पदार्थ की पम्पिंग की अनुमति.
नोट: केयर चैनलों से सभी बुलबुले को दूर करने के लिए निष्क्रिय पम्पिंग विधि का उपयोग करते हुए तरल पदार्थ का प्रवाह की अनुमति के लिए लिया जाना चाहिए. - फिक्स (microfluidic युक्ति) - (छिड़काव चैम्बर) सादे मंच में कॉम्बो और माइक्रोस्कोप एडाप्टर में सादे मंच को ठीक.
- मानक Inlet और आउटलेट (चूषण) मानक ACSF समाधान के साथ मस्तिष्क टुकड़ा का निरंतर छिड़काव के लिए छिड़काव चैम्बर के लिए टयूबिंग कनेक्ट. ACSF समाधान लगातार 95% O2-5% सीओ 2 के साथ से aspirated है .
नोट: छिड़काव चैम्बर के स्नान में ACSF के निरंतर स्तर को बनाए रखने के लिए चूषण टयूबिंग की स्थिति को समायोजित करें. - एक बार छिड़काव चैम्बर ACSF समाधान के साथ भरा है, छिड़काव एक dropper का उपयोग कक्ष में एक मस्तिष्क टुकड़ा जगह है. एक जांच का प्रयोग, microfluidic डिवाइस में परिपत्र के उद्घाटन के ऊपर मस्तिष्क टुकड़ा की स्थिति. एक बार मस्तिष्क टुकड़ा परिपत्र के उद्घाटन पर वांछित स्थान पर है, एक टुकड़ा लंगर का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क टुकड़ा स्थिर.
- microfluidic युक्ति अब विभिन्न तरल पदार्थ के पम्पिंग निष्क्रिय का उपयोग न्यूरोट्रांसमीटर मस्तिष्क स्लाइसें (छिड़काव कक्ष में और microfluidic नेटवर्क के शीर्ष पर रखा) को बेनकाब करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Discussion
मौजूदा macroscale या microscale मस्तिष्क टुकड़ा छिड़काव कक्षों स्थानिक संकल्प वे न्यूरोट्रांसमीटर के साथ मस्तिष्क स्लाइसें को बेनकाब प्रदान के संदर्भ में सीमित कर रहे हैं. microfluidic युक्ति यहाँ प्रदर्शन प्रौद्योगिकी के इस सरल BioMEMS तकनीकों का उपयोग कर सीमा पर काबू पा. यह अनुमान है कि microfluidic डिवाइस के निर्माण और यह मौजूदा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी setups के साथ एकीकृत करने में आसानी में सादगी प्रदर्शन डिवाइस प्रौद्योगिकी के व्यापक आवेदन की अनुमति देगा. दिलचस्प प्रयोगों है कि संभव नहीं थे पहले वर्तमान microfluidic डिवाइस के साथ किया जा सकता है. मस्तिष्क टुकड़ा के विभिन्न microenvironments अलग अलग समय के पैमाने पर अलग न्यूरोट्रांसमीटर को उजागर किया जा सकता है. वर्तमान प्रोटोटाइप डिवाइस केवल चार समानांतर चैनल और एक दूसरे के बगल में स्थित परिपत्र उद्घाटन शामिल है. हालांकि, इस डिवाइस लेआउट आसानी से होता है कि अलग अलग आकार या आकार, या microchannels के उद्घाटन के एक फैशन है कि मस्तिष्क स्लाइसें के विभिन्न microenvironments में खुलने की स्थिति के लिए नेतृत्व करेंगे में meandered हो सकता है अलग अलग डिजाइनों को लागू करने से बदल किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखकों जीव विज्ञान के विभिन्न क्षेत्रों के लिए प्रदर्शन microfluidic प्रौद्योगिकी को शामिल सहयोग के लिए खुले हैं.
Acknowledgments
अनुदान NIH महाराष्ट्र ६४,६११ और NARSAD युवा अन्वेषक पुरस्कार द्वारा प्रदान की गई थी. लेखकों को भी उनके तकनीकी सहायता के लिए एडम Beagley, मार्क Dikopf, और बेन स्मिथ स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-26GPL | Tool | Warner Instruments | W2-64-0236 | Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber |
| SHD-26GH/10 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0253 | Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit |
| Plasma Preen-II 862 | Tool | Plasmatic Systems, Inc. | Microwave plasma system | |
| Model P-1 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0277 | Series 20 Plain Platform, Model P-1 |
| SA-NIK | Tool | Warner Instruments | W2-64-0291 | Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK |
| Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid) | Reagent | Exact composition will vary with application |
References
- Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment. Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).
- Walker, G. M., Beebe, D. J. A passive pumping method for microfluidic devices. Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).
