הכנת E18 נוירונים עכברוש קליפתיים עבור מידור בתוך המכשיר microfluidic

Summary

בסרטון הזה אנחנו מדגימים הכנת E18 עכברוש נוירונים בקליפת המוח.

Abstract

בסרטון הזה אנחנו מדגימים הכנת E18 נוירונים בקליפת המוח עכברוש. E18 נוירונים בקליפת המוח עכברוש מתקבלים קליפת E18 עכברוש העובר גזור בעבר מוכן. קליפת E18 הוא, על לנתיחה, ניתק מיד נוירונים בודדים. אפשר לאחסן E18 קליפת במאגר E שינה המכיל B27 על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע לפני הניתוק מתבצע. עם זאת, תהיה ירידה כדאיות התא. בדרך כלל אנו מקבלים E18 שלנו Cortex טריים. זה מועבר למעבדה של סידן קרים כקרח חינם המאגר מגנזיום לנתיחה בחינם (CMFM). עם ההגעה, טריפסין מתווסף בקליפת לריכוז סופי של 0.125%. קליפת המוח היא מודגרות אז במשך 8 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. DMEM FBS המכיל 10% מתווסף בקליפת להפסיק את התגובה. קליפת המוח היא centrifuged אז בסל"ד 2500 למשך 2 דקות. Supernatant יוסר 2 מ"ל של מדיה בסל עצבית (NBM) המכיל 2% B27 (כרך / כרך א) ו - 0.25% Glutamax (כרך / כרך) נוסף בקליפת המוח אשר מחדש הושעה על ידי pipetting למעלה ולמטה. בשלב הבא, בקליפת הוא triturated בעבר עם מלוטש אש pipettes זכוכית, כל אחד עם פתח קטן רצופים. לאחר triturating, בקליפת הוא centrifuged שוב ב 2500 סל"ד במשך 2 דקות. Supernatant מוסר אז גלולה קליפת מחדש מושעה עם 2 מ"ל של NBM המכיל B27 ו Glutamax. ההשעיה התא לאחר מכן עבר דרך מסננת 40 ניילון אממ התא. הבא התאים נספרים. הנוירונים מוכנים כעת לטעינה לתוך המכשיר נוירון microfluidic.

Protocol

הכנת E18 נוירונים עכברוש עוברית קליפתיים עבור מידור

לפני שמתחילים החוצה, חשוב לחמם את כל התקשורת הדרושים ריאגנטים ל 37 ° C.

חשוב גם לעקר הכל המשמש להכנת תאים (לדוגמה, נורות גומי, מתלים צינור, בקבוקי התקשורת, וכו '), אשר ממוקם מכסה המנוע, על ידי מנגב עם אתנול 70%.

1. מניחים שתי פיסות Cortex E18 עכברוש עוברית (אחד במוח, גזור בעבר) בתוך שפופרת המכילה 15 מ"ל 1 קר כקרח מ"ל סידן ללא מגנזיום ללא דיסקציה חיץ.
2. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לקליפת המוח במאגר לנתיחה, כדי להביא את נפח סופי 2 מ"ל ריכוז טריפסין הסופי 0.125%.
3. מניחים את הצינור 15 מ"ל אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים במשך 8 דקות.
4. במהלך תקופה זו, אש פולנית 3 כוס פסטר pipets, ויצרו פתחים קטנים ברציפות, בארון biosafety כדי לעזור לשמור על סטריליות.
5. לאחר דגירה 8 דקות של קליפת המוח, להוסיף 10 מ"ל של DMEM FBS המכיל 10% עד קליפת המוח כדי לעזור לעצור את התגובה טריפסין.
6. צנטריפוגה שפופרת המכילה 15 מ"ל קליפת ו DMEM/10% FBS בסל"ד 2500 למשך 2 דקות.
7. בארון biosafety, להסיר את supernatant מהקורטקס באמצעות pipet פסטר זכוכית עם יניקה ואקום המצורפת. היזהר שלא להפריע או לעקור את גלולה.
8. הוסף 1 מ"ל של NMB אל קליפת המוח גלולה pipet בעדינות מעלה ומטה. חשוב מאוד כדי למנוע יצירת בועות אוויר בזמן pipeting למעלה ולמטה, כמו בועות אוויר עלול לגרום נזק לתאים על ידי חמצון.
9. השתמש אש מלוטש pipet פסטר עם פתיחת רחב כדי triturate קליפת המוח על ידי הצמדת נורה גומי סטרילי עד הסוף pipeting למעלה ולמטה 5 פעמים, שוב נזהר שלא להכניס בועות אוויר. המשך בתהליך זה עם 2 pipets אחרים זכוכית, כל אחד עם גודל הפתח ירד.
10. לאחר טחינה דקה, צנטריפוגה את התאים שוב בסל"ד 2500 למשך 2 דקות.
11. לאחר צנטריפוגה, שוב להסיר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 2 מ"ל של NBM.
12. סנן הפתרון תא resuspended דרך מסננת 45 תא אממ.
13. הכתם התאים עם Trypan כחול, לספור, נטען לתוך המכשירים. אנחנו בדרך כלל עומס 20 ul של תאים לכל מכשיר.

הערה: את הריכוז הסופי של התאים הוא בדרך כלל בין 2.5 מיליון תאים / מ"ל ו - 8,000,000 תאים / מ"ל

טוען את התאים

אחרי תאים נספרו, זה הזמן לטעון את התאים המכשיר:

1. תביאו את המכשירים מוכנים בעבר המכיל NBM לארון biosafety לשמור על סטריליות.
2. הסר מדיה עודף מבארות באמצעות יניקה ואקום. עם זאת, להיזהר הסרת כל אמצעי התקשורת - בטח יש ערוץ התקשורת העיקרי.
3. החל 20 ul של תאים למאגר היד בפינה השמאלית העליונה של המכשיר (ראה תרשים במידת הצורך). זרימת התאים לתוך המכשיר ולצרף אל פני השטח טופלו PLL.
4. לאחר הטעינה, במקום מכשירים המכיל תאים בחזרה באינקובטור במשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף.
5. לאחר 10 דקות, למלא את המאגרים עם התקשורת והתקנים מקום בחזרה בחממה.

Discussion

צפיפות תאים יכולים להיות מגוונים בהתאם ליישום. עם זאת, זריעת נוירונים העיקרי בבית נמוך מדי של צפיפות בדרך כלל מוביל מוות של תאים. בהתאם החממה ועל רמת לחות, מדיה ייתכן שיהיה צורך לשנות את המכשירים כל 2 עד 3 ימים. בעת שינוי התקשורת, חשוב לאחר הסרת התקשורת ממאגרים, מעולם לא להסיר את ערוצי התקשורת העיקריים. יתר על כן, זהו תרגול טוב למקום התקשורת טרי בארות העליון לאפשר כמה התקשורת טרי לזרום דרך המכשיר לתוך ערוצים עיקריים לפני ממלא את כל המאגרים.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NBM	medium	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
E18 rat embryos	Animal			Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.
CMFM dissection buffer HBSS	buffer			ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.
15 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
0.25% Trypsin-EDTA	Reagent	Invitrogen
37˚C water bath
Pasteur pipets		Fisher Scientific		glass
DMEM	medium	Invitrogen
FBS	Reagent	Invitrogen		serum, used at 10% in DMEM
centrifuge				set at 2500 rpm
Trypan Blue		Invitrogen		for counting live/dead cells
BD Falcon Cell Strainer 40 um	Tool	BD Biosciences	Falcon cat# 352340	Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.