Immunohistochemie: Paraffinecoupes Met behulp van de Vectastain ABC Kit van Vector Labs

Summary

Abstract

Immunohistochemie (IHC) is een waardevolle techniek gebruikt om te lokaliseren / eiwit expressie te visualiseren in een gemonteerde weefselsectie met behulp van specifieke antilichamen. Er zijn twee methoden: de directe en indirecte methode. In dit experiment zullen we alleen maar beschrijven het gebruik van indirecte IHC kleuring. Indirecte IHC kleuring maakt gebruik van zeer specifieke primaire en biotine-geconjugeerd secundair antilichamen. Primaire antilichamen worden gebruikt om discreet eiwitten van belang te identificeren door te binden aan een specifiek epitoop, terwijl de secundaire antilichamen af ​​te trekken voor niet-specifieke achtergrond kleuring en versterken het signaal door het vormen van complexen aan de primaire antilichaam. Dia's kunnen worden gegenereerd op basis van vriescoupes of paraffine ingebedde coupes gemonteerd op glasplaatjes. In dit protocol, bespreken we de voorbereiding van de paraffine ingebedde coupes door het verwijderen, hydratatie met behulp van een gradiënt van alcohol, warmte geïnduceerde antigen retrieval, en het blokkeren van endogene peroxidase activiteit en niet-specifieke bindingsplaatsen. Sommige delen worden vervolgens gekleurd met antilichamen die specifiek zijn voor T-cel marker CD8 en terwijl anderen zijn gekleurd voor tyrosine hydroxylase. De dia's worden vervolgens behandeld met de juiste secundaire antilichamen geconjugeerd aan biotine, ontwikkelde vervolgens gebruik te maken van avidine-geconjugeerd mierikswortelperoxidase (HRP) met Diaminiobenzidine (DAB) als substraat. Na ontwikkeling worden de dia's tegengekleurd voor contrast, en gemonteerd onder dekglaasjes met Permount. Na voldoende droging, zijn deze dia's zijn dan klaar voor de beeldvorming.

Protocol

Kleuring van paraffine secties

1. Dewax dia's met xyleen (Fisher X3 ^S -4) 3x gedurende 5 minuten elk (verandering xyleen elke maand afhankelijk van het gebruik, xyleen is giftig). Gebruik gerechten en covers voor 20 dia's van Fisher ref 08-812-1A en rekken gemaakt om deze gerechten te passen. 200 ml vloeistof per schotel.
2. Hydrate door alcohol gradiënt als volgt uit (wijzigingen gradiënt om de 2 weken):
   • 2x in 100% ethanol (Fisher # A406-20) gedurende 2 minuten per
   • 2x in 95% ethanol gedurende 2 minuten per
   • 1x in 70% ethanol gedurende 2 minuten
   • 1x in 50% ethanol gedurende 2 minuten
   • 1x in 30% ethanol gedurende 2 minuten
   • 1x DDH ₂ O gedurende 2 minuten
3. Dompel onder in DPBS gedurende 5 minuten (DPBS = gewijzigd fosfaat Dulbecco's gebufferde zoutoplossing met Ca ^{2 +} en Mg ^{2 +).}

Antigen herstel:

1. Verwarm de Na-citraat buffer (10 mM, pH 6,5) in de magnetron.
2. Kook de dia's voor 15 min in de magnetron. De dia's mogen nooit droog dus check iedere minuut en voeg Na-Citraat wanneer dat nodig is.
3. Laat afkoelen op kamertemperatuur.
4. Block endogene peroxidase-activiteit met 1% H ₂ O ₂ in DPBS gedurende 20 min (1,5 ml van 30% aandelen Sigma H-1009 in 50 ml DPBS).
5. Dompel onder in DPBS 3 x 5 minuten.
6. Blokkeer niet-specifieke sites door incubatie overnacht bij +4 ° C in DPBS + 5% bovine serum albumine (BSA) + 0,1% Na Azide + 5% serum.
   
   Let op: Keuze van serum zal afhangen van de soorten waarbij antilichamen gebruikt voor het kleuren werden gemaakt. Blok met serum van de soorten waarbij de secundaire Ab (geconjugeerd aan biotine) werd gemaakt. Als dit niet beschikbaar is, gebruik serum van een andere soort dan van de een, waarin de primaire Ab werd gemaakt.
   
   
7. Blokkeer de biotine sites met de avidine / biotine blokkeren kit (Vector laboratoria catalogus # SP-2001):
   • Incubeer met avidine D gedurende 15 minuten. Spoel kort met DPBS.
   • Incubeer met de biotine-oplossing gedurende 15 minuten.
8. Incubeer in het primair Ab gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, in DPBS + 2% BSA + 0,1% NaAzide + 2% serum (dezelfde als voor het blokkeren van stap).
9. Soak in PBS 3 x 5 minuten.
10. Incubeer met de secundaire Ab geconjugeerd met biotine gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in DPBS + 2% BSA + 0,1% Na Azide + 2% serum (zelfde als gebruikt voor het blokkeren stap).
11. Bereid ABC reagens op hetzelfde moment, omdat het te ontwikkelen voor ten minste 30 minuten voor gebruik! (Zie ook Materiaal)
12. Bereid in een 50 ml conische buis. In 15 ml DPBS (geen serum, geen azide) voeg 3 druppels reagens A, mix en voeg 3 druppels reagens B en meng. Vermijd knijpen de flessen, in plaats van wachten tot de druppels te vormen op hun eigen. ABC kit Vectastain PK-6100 van Vector Labs.
13. Dompel onder in DPBS 3 x 5 minuten.
14. Incubeer met ABC reagens voor 30-45 min bij kamertemperatuur.
15. Dompel onder in DPBS 3 x 5 minuten.
16. Bereid DAB peroxidase substraat (Vector Labs # SK-4100) in 5 ml DDH ₂ O in een glazen flacon onmiddellijk vóór gebruik (zie ook Materiaal)
    • 2 druppels buffervoorraad oplossing, mengen
    • 4 druppels van DAB, mix (zou moeten worden een beetje bruin)
    • 2 druppels H ₂ O _2, mix
17. Drop de DAB substraat op de top van de dia's en let op bruine vlekken.
18. Dompel dia's in ijs + leidingwater om de reactie te stoppen.
19. Afspoelen onder koud leidingwater gedurende 5 minuten.
20. Tegenkleuring met hematoxyline (20 sec; Fisher CS401-D) en spoelen in leidingwater totdat er water uit te wissen.
21. Uitdrogen door alcohol gradiënt te beginnen bij 30% ethanol tot 100% ethanol (2 min. elk).
22. Soak in xyleen 3 x 5 minuten.
23. Mount met Permount (Fisher # SP15-100): zet een aantal boven het gedeelte op de dia en druk op langzaam op de afdeling met een dekglaasje zonder luchtbellen. Beweeg niet het dekglaasje tot het volledig droog, dat duurt ~ 24 uur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Use to make EtOH gradient.
DPBS			Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+
Na-Citrate buffer			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	30% stock => Dilute to 1% in DPBS
Blocking solution			DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum.
BSA
Sodium Azide			NaAzide
avidin/biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2001
Ab buffer			DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)
ABC kit Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin	Fisher Scientific	CS401-D	counterstain
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Slides and cover-slips			glass