Summary
Abstract
Иммуногистохимии (IHC) является ценным техника используется для локализации / визуализации экспрессии белка установлен срез ткани с использованием специфических антител. Есть два метода: прямой и косвенный метод. В этом эксперименте мы будем только описывают использование косвенных окрашивания IHC. Косвенные окрашивания IHC использует весьма специфический первичный и биотин, конъюгированных вторичных антител. Первичные антитела используются для дискретно идентифицировать белки интереса путем связывания с конкретным эпитопом, а вторичные антитела вычесть для неспецифического фона окрашивания и усиливать сигнал, образуя комплексы с первичным антителом. Слайды могут быть либо генерируется из замороженных срезах, или парафин разделы монтируются на стеклах. В этом протоколе, мы обсудим подготовку парафин разделы по депарафинизации, гидратация использованием алкоголя градиент, тепло-индуцированной поиска антигена, и блокирования эндогенной активности пероксидазы и неспецифического связывания объектов. Некоторые разделы затем окрашивали антителами, специфичными для Т-клеток CD8 маркеров и в то время как другие окрашивают в течение тирозингидроксилазы. Слайды впоследствии лечат вторичных антител, конъюгированных с биотином, то разработаны с использованием авидин конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) с Diaminiobenzidine (DAB) в качестве субстрата. После развития, слайды контрастно для контраста, и монтировать под покровные с permount. После адекватной сушки, эти слайды готово для работы с изображениями.
Protocol
Окраска парафиновых срезов
- DEWAX слайды с Ксилол (Fisher X3 S -4) 3 раза в течение 5 минут каждый (изменение ксилола каждый месяц в зависимости от использования, ксилол является токсичным). Используйте посуду и обложки для 20 слайдов с Фишером реф 08-812-1A и стойки сделаны с учетом этих блюд. 200 мл жидкости за блюдо.
- Гидратов через алкоголь градиент следующим образом (изменение градиента каждые 2 недели):
- 2x в 100% этанола (Fisher # A406-20) в течение 2 минут каждый
- 2x в 95% этилового спирта в течение 2 минут каждый
- 1x в 70% этилового спирта в течение 2 мин
- 1x в 50% этилового спирта в течение 2 мин
- 1x в 30% этилового спирта в течение 2 мин
- 1x DDH 2 O в течение 2 мин
- Замочите в DPBS в течение 5 мин (DPBS = изменение фосфат Дульбеко буферным раствором с Са 2 + и Mg 2 +).
Антиген восстановления:
- Разогреть Na-цитрат буфера (10 мМ, рН 6,5) в микроволновой печи.
- Кук слайды в течение 15 мин в микроволновой печи. Слайды никогда не должна пересыхать так что проверить каждую мин и добавляют Na-цитрат в случае необходимости.
- Дайте остыть при комнатной температуре.
- Блок эндогенной активности пероксидазы с 1% H 2 O 2 в DPBS в течение 20 мин (1,5 мл 30% акций Sigma H-1009 в 50 DPBS мл).
- Замочите в DPBS 3 х 5 мин.
- Блок неспецифических сайтов путем инкубации в течение ночи при +4 ° С в DPBS + 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) + 0,1% азида Na + 5% сыворотки.
Примечание: Выбор сыворотки будет зависеть от вида, в которых антитела используются для окрашивания были сделаны. Блок с сывороткой видов, в которых вторичные Ab (конъюгированные с биотином) было сделано. Если этого нет, используйте сыворотки от вида отличается от той, в которой основной Ab было сделано.
- Блок биотин сайты с авидин / биотин блокирующий комплект (Vector лабораторий Каталог # SP-2001):
- Инкубируйте с авидин D в течение 15 мин. Промыть кратко DPBS.
- Инкубируйте с решением биотина в течение 15 мин.
- Инкубируйте в начальной Ab в течение 2 часов при комнатной температуре, в DPBS + 2% BSA + 0,1% NaAzide + 2% сыворотки (то же, для блокировки шаг).
- Замочите в PBS 3 х 5 мин.
- Инкубируйте с вторичным Ab сопряженных с биотином в течение 1 часа при комнатной температуре в DPBS + 2% BSA + 0,1% азида Na + 2% сыворотки (то же, используются для блокировки шаг).
- Подготовка ABC реагента в то же время, поскольку он должен развиваться, по крайней мере 30 минут перед использованием! (См. материалы)
- Подготовка в 50 мл коническую трубку. В 15 DPBS мл (без сыворотки, не азид) добавить 3 капли реагента, перемешать и добавить 3 капли реагента B и перемешать. Не следует помещать бутылки, а ждать капли сформировать самостоятельно. ABC комплект Vectastain PK-6100 от векторного Labs.
- Замочите в DPBS 3 х 5 мин.
- Инкубируйте с реагентом ABC в течение 30-45 минут при комнатной температуре.
- Замочите в DPBS 3 х 5 мин.
- Подготовка субстрата пероксидазы DAB (Vector Labs # SK-4100) в 5 мл DDH 2 O в стеклянном флаконе непосредственно перед использованием (см. материалы)
- 2 капли буферного раствора акции, перемешать
- 4 капли DAB, смеси (должен стать чуть-коричневый)
- 2 капли Н 2 О 2, перемешать
- Оставьте DAB подложки, на вершине горки и следить за коричневой окраски.
- Dip слайды в лед + водопроводную воду, чтобы остановить реакцию.
- Промыть под холодной водопроводной водой в течение 5 мин.
- Контрастирующая с гематоксилин (20 сек; Фишер CS401-D) и промыть в проточной воде, пока вода не выходит ясно.
- Дегидрировать через алкоголь градиент, начиная с 30% этанолом до 100% этилового спирта (2 мин каждый).
- Замочите в ксилоле 3 х 5 мин.
- Установить при помощи Permount (Fisher # SP15-100): поставить некоторые выше раздел о слайда и нажмите медленно на секции с покровным без пузырьков воздуха. Не перемещайте покровное до полного высыхания, которое занимает ~ 24 часов.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC. |
100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Use to make EtOH gradient. |
DPBS | Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+ | ||
Na-Citrate buffer | 10 mM, pH 6.5 | ||
H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | 30% stock => Dilute to 1% in DPBS |
Blocking solution | DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum. | ||
BSA | |||
Sodium Azide | NaAzide | ||
avidin/biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2001 | |
Ab buffer | DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step) | ||
ABC kit Vectastain PK-6100 | Vector Laboratories | ||
DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | |
ddH2O | |||
Hematoxylin | Fisher Scientific | CS401-D | counterstain |
Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
Slides and cover-slips | glass |