Summary
Abstract
Imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica valiosa utilizada para localizar / visualizar a expressão da proteína em uma seção de tecido montado usando anticorpos específicos. Existem dois métodos: o método direto e indireto. Neste experimento, vamos apenas descrever o uso de coloração IHQ indiretos. Coloração IHC indireta utiliza altamente específicos primário e biotina conjugado com anticorpos secundários. Anticorpos primários são utilizados para identificar discretamente proteínas de interesse por ligação a um epítopo específico, enquanto anticorpos secundários subtrair para não-específica coloração de fundo e amplificar o sinal através da formação de complexos com o anticorpo primário. Slides podem ser gerados a partir de cortes congelados, ou parafina incorporada montados em lâminas de vidro. Neste protocolo, discutimos a preparação de parafina seções por hidratação desparafinação, usando um gradiente de álcool, a recuperação de calor antígeno induzido, e bloqueio da atividade da peroxidase endógena e não-específicas sítios de ligação. Algumas seções são então coradas com anticorpos específicos para T CD8 e marcador de células, enquanto outras estão manchadas de tirosina hidroxilase. Os slides são posteriormente tratados com anticorpos secundários conjugados apropriado para biotina, então desenvolvido utilizando conjugado avidina-peroxidase (HRP) com Diaminiobenzidine (DAB) como substrato. Na sequência do desenvolvimento, as lâminas são contracorados de contraste e montado sob lamínulas com Permount. Após a secagem adequada, estes slides estão prontas para a imagem latente.
Protocol
Coloração de secções de parafina
- Dewax slides com xileno (Fisher X3 S -4) 3x por 5 minutos cada (xileno mudam a cada mês, dependendo do uso, xileno é tóxico). Use pratos e tampas para 20 slides de Fisher ref 08-812-1A e racks feito para caber esses pratos. 200 ml de líquido por prato.
- Hidratar por meio de gradiente de álcool da seguinte forma (mudança de gradiente a cada 2 semanas):
- 2x em etanol 100% (Fisher # A406-20) por 2 min cada
- 2x em etanol 95% por 2 min cada
- 1x em etanol 70% por 2 min
- 1x em etanol 50% por 2 min
- 1x em etanol 30% por 2 min
- 1x DDH 2 O por 2 min
- Mergulhe na DPBS por 5 min (DPBS = fosfato modificado Dulbecco Buffered Saline com Ca 2 + e Mg 2 +).
Recuperação do antígeno:
- Pré-aqueça o tampão a Na-Citrato (10 mM, pH 6,5) no microondas.
- Cozinhe as lâminas durante 15 min no microondas. Os slides não devem secar para verificar cada min e adicionar Na-Citrato, quando necessário.
- Deixe esfriar em temperatura ambiente.
- Bloquear a atividade da peroxidase endógena com 1% de H 2 O 2 em DPBS por 20 min (1,5 ml de estoque 30% Sigma H-1009 em 50 DPBS ml).
- Mergulhe na DPBS 3 x 5 min.
- Bloco non-sites específicos por incubação durante a noite a 4 ° C em DPBS + 5% de albumina sérica bovina (BSA) + 0,1% Na Azida + 5% de soro.
Nota: A escolha de soro irá depender da espécie em que os anticorpos utilizados para a coloração foram feitas. Bloco com soro de espécies em que o Ab secundário (conjugado com biotina) foi feita. Se este não estiver disponível, use soro de uma espécie diferente daquele em que o Ab primário foi feito.
- Bloquear os sites com a biotina avidina / biotina bloqueio kit (Vector laboratórios de catalogo SP-2001):
- Incube com Avidin D por 15 min. Lave brevemente com DPBS.
- Incube com a solução de biotina por 15 min.
- Incubar em Ab primário para 2 horas em temperatura ambiente, em DPBS + 2% BSA NaAzide + 0,1% + 2% de soro (o mesmo que para Bloqueio de passo).
- Mergulhe em PBS 3 x 5 min.
- Incube com a Ab secundário conjugado com biotina por 1 hora em temperatura ambiente + 2% + 0,1% BSA Na Azida + 2% de soro (mesmo utilizado para a etapa de bloqueio). DPBS em
- Preparar o reagente ABC, ao mesmo tempo porque tem que desenvolver para pelo menos 30 min antes de usar! (Veja Materiais)
- Prepare em um tubo de 50 ml. Em 15 DPBS ml (sem soro, sem azida) adicionar 3 gotas do reagente A, misturar e adicionar 3 gotas de reagente B e misturar. Evite apertar as garrafas, e não esperar que as gotas para formar por conta própria. ABC kit Vectastain PK-6100 da Vector Labs.
- Mergulhe na DPBS 3 x 5 min.
- Incube com reagente ABC por 30-45 min em temperatura ambiente.
- Mergulhe na DPBS 3 x 5 min.
- Prepare DAB substrato peroxidase (Vector Labs # SK-4100) em 5 ml DDH 2 O num frasco de vidro imediatamente antes do uso (ver Materiais)
- 2 gotas de solução de estoque regulador, mix
- 4 gotas de DAB, mix (deve ficar ligeiramente marrom)
- 2 gotas H 2 O 2, mix
- Soltar o substrato DAB em cima dos slides e assistir a coloração marrom.
- Dip slides em gelo + água da torneira para parar a reação.
- Enxágüe em água corrente fria por 5 min.
- Contracoloração com hematoxilina (20 seg; Fisher CS401-D) e enxaguar em água corrente até que a água sai clara.
- Desidratar através de gradiente de álcool a partir de etanol 30% até 100% de etanol (2 min cada).
- Mergulhe em xileno 3 x 5 min.
- Montagem com Permount (Fisher # SP15-100): ponha algumas acima a seção sobre o slide e pressione lentamente para a seção com uma lamela, sem bolhas de ar. Não mova a lamela até que esteja completamente seco, o que leva ~ 24 horas.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC. |
100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Use to make EtOH gradient. |
DPBS | Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+ | ||
Na-Citrate buffer | 10 mM, pH 6.5 | ||
H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | 30% stock => Dilute to 1% in DPBS |
Blocking solution | DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum. | ||
BSA | |||
Sodium Azide | NaAzide | ||
avidin/biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2001 | |
Ab buffer | DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step) | ||
ABC kit Vectastain PK-6100 | Vector Laboratories | ||
DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | |
ddH2O | |||
Hematoxylin | Fisher Scientific | CS401-D | counterstain |
Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
Slides and cover-slips | glass |