Immunoistochimica: sezioni di paraffina Utilizzando il Vectastain ABC Kit Labs Vector

Summary

Abstract

Immunoistochimica (IHC) è una tecnica di valore utilizzata per localizzare / visualizzare l'espressione della proteina in una sezione di tessuto montato utilizzando anticorpi specifici. Ci sono due metodi: il metodo diretto e indiretto. In questo esperimento, ci sarà solo descrivono l'uso indiretto di colorazione IHC. Indiretto colorazione IHC utilizza anticorpi primari e biotina coniugato altamente specifici secondari. Anticorpi primari sono utilizzati per identificare le proteine ​​di discreto interesse legandosi ad uno specifico epitopo, mentre gli anticorpi secondari per sottrarre colorazione aspecifica di fondo e amplificare il segnale formando complessi per l'anticorpo primario. Le diapositive possono essere generati da sezioni congelate, o le sezioni in paraffina montate su lastre di vetro. In questo protocollo, si discute la preparazione di paraffina sezioni dalla deparaffinazione, idratazione con un gradiente di alcool, recupero dell'antigene calore indotto, e il blocco dell'attività perossidasica endogena e siti di legame non specifici. Alcune sezioni sono poi colorate con anticorpi specifici per il marcatore delle cellule T CD8 e mentre altri sono macchiati di tirosina idrossilasi. Le diapositive vengono successivamente trattati con appropriati anticorpi secondari coniugati con biotina, poi sviluppato utilizzando avidina coniugata con perossidasi di rafano (HRP) con Diaminiobenzidine (DAB) come substrato. Seguendo lo sviluppo, le diapositive sono controcolorate per contrasto, e montato sotto coprioggetto con permount. Dopo l'essiccazione adeguata, queste diapositive sono pronti per l'imaging.

Protocol

Colorazione di sezioni di paraffina

1. Sparaffinatura diapositive con xilene (Fisher X3 ^S -4) 3 volte per 5 minuti ciascuno (xilene cambiano ogni mese a seconda dell'uso, xilene è TOSSICA). Usare piatti e copertine per 20 vetrini da Fisher rif 08-812-1A e rack su misura per questi piatti. 200 ml di liquido per piatti.
2. Idrato attraverso gradiente alcool come segue (cambio gradiente ogni 2 settimane):
   • 2x in 100% di etanolo (Fisher # A406-20) per 2 minuti ciascuno
   • 2x in etanolo al 95% per 2 minuti ciascuno
   • 1x in etanolo al 70% per 2 minuti
   • 1x in etanolo al 50% per 2 minuti
   • 1x a 30% di etanolo per 2 minuti
   • 1x DDH ₂ O per 2 minuti
3. Mettere a bagno in DPBS per 5 min (= DPBS fosfato modificato Dulbecco Soluzione salina tamponata con Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +).}

Antigen di recupero:

1. Preriscaldare il tampone Na-citrato (10 mM, pH 6,5) nel forno a microonde.
2. Cuocere le diapositive per 15 minuti nel forno a microonde. Le slide non deve mai asciugare in modo da controllare ogni minuto e aggiungere Na-citrato quando necessario.
3. Lasciate raffreddare a temperatura ambiente.
4. Bloccare l'attività della perossidasi endogena con 1% di H ₂ O ₂ in DPBS per 20 min (1,5 ml di 30% magazzino Sigma H-1009 DPBS in 50 ml).
5. Mettere a bagno in DPBS 3 x 5 min.
6. Blocco non specifici siti incubando una notte a +4 ° C in DPBS + 5% di sieroalbumina bovina (BSA) + 0,1% azide Na + 5% di siero.
   
   Nota: La scelta di siero dipenderà specie in cui sono state fatte anticorpi utilizzati per la colorazione. Blocco con siero dal specie in cui è stata fatta la Ab secondario (coniugato con biotina). Se questo non è disponibile, utilizzare siero di una specie diversa da quella in cui è stata fatta la Ab primario.
   
   
7. Bloccare i siti biotina con l'avidina / biotina blocco kit (Vector laboratori catalogo SP-2001):
   • Incubare con avidina D per 15 minuti. Sciacquare brevemente con DPBS.
   • Incubare con la soluzione di biotina per 15 minuti.
8. Incubare in Ab primario per 2 ore a temperatura ambiente, in DPBS + 2% BSA NaAzide + 0,1% + 2% di siero (come per blocco passo).
9. Mettere a bagno in PBS 3 x 5 min.
10. Incubare con l'Ab secondario coniugato con la biotina per 1 ora a temperatura ambiente in DPBS + 2% BSA + 0,1% Na azide + 2% di siero (lo stesso usato per il passo di blocco).
11. Preparare il reagente ABC allo stesso tempo, perché deve sviluppare per almeno 30 minuti prima dell'uso! (Vedi Materiali)
12. Preparare in una provetta da 50 ml. In 15 DPBS ml (senza siero, senza azide) aggiungere 3 gocce di reagente A, mescolare e aggiungere 3 gocce di reagente B e mescolare. Evitare di schiacciare le bottiglie, invece attendere le gocce per formare da soli. ABC Kit Vectastain PK-6100 da Labs Vector.
13. Mettere a bagno in DPBS 3 x 5 min.
14. Incubare con reagente ABC per 30-45 minuti a temperatura ambiente.
15. Mettere a bagno in DPBS 3 x 5 min.
16. Preparare substrato DAB perossidasi (Vector Labs # SK-4100) in 5 ml DDH ₂ O in un flacone di vetro immediatamente prima dell'uso (vedi Materiali)
    • 2 gocce di soluzione tampone magazzino, miscelare
    • 4 gocce di DAB, mix (dovrebbe diventare leggermente marrone)
    • 2 gocce di H ₂ O _2, mescolare
17. Cadere il substrato DAB sopra delle diapositive e guardare per la colorazione marrone.
18. Immergere i vetrini in ghiaccio + acqua di rubinetto per fermare la reazione.
19. Sciacquare sotto l'acqua corrente fredda per 5 minuti.
20. Di contrasto con ematossilina (20 sec; Fisher CS401-D) e sciacquare con acqua finché l'acqua fuoriesce chiaro.
21. Disidratare attraverso la pendenza di alcol a partire da 30% di etanolo fino al 100% di etanolo (2 minuti ciascuno).
22. Mettere a bagno in xilene 3 x 5 min.
23. Monta con Permount (Fisher # SP15-100): mettere un po 'sopra la sezione sul vetrino e premere lentamente sulla sezione con un coprioggetto senza bolle d'aria. Non spostare il coprioggetto fino a completa asciugatura, che si ~ 24 ore.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Use to make EtOH gradient.
DPBS			Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+
Na-Citrate buffer			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	30% stock => Dilute to 1% in DPBS
Blocking solution			DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum.
BSA
Sodium Azide			NaAzide
avidin/biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2001
Ab buffer			DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)
ABC kit Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin	Fisher Scientific	CS401-D	counterstain
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Slides and cover-slips			glass