免疫組織化学：ベクターLabsからベクタステインABCキットを用いたパラフィン切片

Summary

Abstract

免疫組織化学（IHC）は、ローカライズ/特異的な抗体を使用して、マウントされた組織切片でのタンパク質発現を視覚化するために利用価値のある技術です。直接的および間接的な方法：2つの方法があります。この実験では、我々は唯一の間接的なIHC染色の使用について説明します。間接IHC染色は特異性の高いプライマリおよびビオチン標識二次抗体を利用しています。一次抗体は、離散的に二次抗体が非特異的なバックグラウンド染色のために減算し、一次抗体に複合体を形成することにより信号を増幅しながら、特定のエピトープに結合することにより目的のタンパク質を識別するために利用されています。スライドは、どちらの凍結切片から生成、またはパラフィン包埋切片をガラススライドにマウントすることができます。このプロトコルでは、我々は、内因性ペルオキシダーゼ活性と非特異的結合部位のアルコールの勾配を使用して脱ろう、水和、熱誘導抗原の検索、および遮断することにより、パラフィン包埋切片の準備について説明します。いくつかのセクションは、T細胞マーカーCD8特異的な抗体で染色されているものと、チロシン水酸化酵素のために染色されている間。スライドが続いてビオチンに結合した適切な二次抗体で処理し、次いで基質としてDiaminiobenzidine（DAB）とアビジン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を利用して開発した。開発に続いて、スライドは、コントラストのために対比されている、とpermountでカバースリップの下にマウント。十分乾燥した後、これらのスライドは、イメージングのための準備が整いました。

Protocol

パラフィン切片の染色

1. 〜からろうを除去するが、各5分間3倍キシレン（フィッシャーX3 ^S -4）とスライド（用途に応じて毎月変更キシレン、キシレンは毒性があります）。これらの料理に合うように作られたフィッシャーREFから20のスライド08から812 - 1Aとラックの皿とカバーを使用してください。皿あたり200 mlの液体。
2. 次のようにアルコールの勾配を介して水和物（2週間毎に勾配を変更）​​：
   • 2分ごとに100％エタノール（フィッシャー＃A406 - 20）で2倍
   • 2分ごとに95％エタノールで2倍
   • 2分間70％エタノールに1倍
   • 2分間50％エタノールに1倍
   • 2分間30％エタノールに1倍
   • 2分間1XのddH ₂ O
3. 5分（DPBS =ダルベッコ改変リン酸はCa ^{2 +}およびMg ^{2 +}との緩衝生理食塩水）のためのDPBSに浸す。

抗原の回復：

1. 電子レンジで予備加熱ナトリウム - クエン酸緩衝液（10mMの、pHは6.5）。
2. 電子レンジで15分間スライドを焼く。スライドは、すべての分をチェックし、Naのクエン酸、必要に応じて追加するように乾かしてはいけません。
3. 室温で冷ます。
4. H _2は 20分（30％ストック50 mlのDPBSでシグマH - 1009を1.5 ml）のためのDPBSでO ₂ 1％で内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックする。
5. DPBS 3 × 5分に浸る。
6. +4℃DPBSでC + 5％ウシ血清アルブミン（BSA）+ 0.1％のNaアジド+ 5％血清で一晩インキュベートすることにより、非特異的部位をブロックする。
   
   注：血清の選択は、染色に使用される抗体が行われた種に依存します。二次抗体は、（ビオチンに結合体化）が行われた種からの血清でブロック。これが利用できない場合は、一次抗体が行われたものとは異なる種からの血清使用。
   
   
7. アビジン/ビオチンブロッキングキット（ベクターラボラトリーズカタログ＃SP - 2001）とビオチンのサイトをブロックする：
   • 15分間アビジンDでインキュベートする。 DPBSで簡単にすすいでください。
   • 15分間ビオチン溶液でインキュベートする。
8. DPBSで室温で2時間、+ 2％BSA + 0.1％NaAzide +血清2％（ステップをブロッキングと同様）のために一次抗体でインキュベートする。
9. PBSで3 × 5分に浸る。
10. DPBSで室温で1時間+ 2％にビオチンを結合させた二次抗体とアジ化ナトリウムBSA + 0.1％+血清2％（ブロッキングのステップのために使われるのと同じ）インキュベートする。
11. それは使用前に少なくとも30分間を開発する必要があるため、同時にABC試薬を準備します！ （資料を参照してください）
12. 50 mlコニカルチューブに準備します。 15mlのDPBS（無血清、無アジ化）で試薬を3滴、ミックスを追加し、試薬Bとミックスの3滴を追加します。ボトルを強く握ったりしないで、むしろ自分自身で形成するためにドロップを待ちます。 ABCキットステインPK - 6100ベクトルLabsから。
13. DPBS 3 × 5分に浸る。
14. 室温で30-45分のためのABC試薬でインキュベートする。
15. DPBS 3 × 5分に浸る。
16. 使用直前にガラスバイアルに5ミリリットルのddH ₂ OにおけるDABのペルオキシダーゼ基質（ベクターラボ＃SK - 4100）を準備する（資料を参照してください）
    • バッファーのストック溶液を2滴、ミックス
    • DAB、ミックスの4滴（少し茶色になるはず）
    • 2滴H ₂ O _2、ミックス
17. 茶色の染色用スライド、時計の上にDAB基質をドロップします。
18. 氷にディップスライド+反応を停止させる水をタップ。
19. 5分間冷たい水道水ですすいでください。
20. ヘマトキシリン​​（20秒、フィッシャーCS401 - D）との対比と水が出て明らかになるまで水道水ですすいでください。
21. 最大100％エタノール（2分ごと）に30％エタノールで出発アルコールの勾配によって脱水。
22. キシレン3 × 5分に浸る。
23. Permountとマウント（フィッシャー＃SP15 - 100）：いくつかのスライド上にセクションの上に置くと、気泡のないカバーとセクションの上にゆっくりと押してください。 〜24時間かかりますれ、完全に乾燥するまで、カバースリップを移動しないでください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Use to make EtOH gradient.
DPBS			Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+
Na-Citrate buffer			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	30% stock => Dilute to 1% in DPBS
Blocking solution			DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum.
BSA
Sodium Azide			NaAzide
avidin/biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2001
Ab buffer			DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)
ABC kit Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin	Fisher Scientific	CS401-D	counterstain
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Slides and cover-slips			glass