Immunohistochimie: coupes en paraffine utilisant le kit de Vectastain ABC Vector Labs

Summary

Abstract

L'immunohistochimie (IHC) est une technique intéressante utilisée pour localiser / visualiser l'expression des protéines dans une section de tissu monté en utilisant des anticorps spécifiques. Il existe deux méthodes: la méthode directe et indirecte. Dans cette expérience, nous allons seulement décrire l'utilisation de l'IHC coloration indirecte. Indirects coloration IHC utilise très spécifiques primaires et de la biotine-anticorps secondaires conjugués. Les anticorps primaires sont utilisés pour identifier discrètement des protéines d'intérêt en se liant à un épitope précis, alors que les anticorps secondaires soustrait pour la coloration de fond non spécifique et d'amplifier le signal en formant des complexes à l'anticorps primaire. Les diapositives peuvent être soit générée à partir de coupes congelées, ou des sections paraffine montés sur lames de verre. Dans ce protocole, nous discutons de la préparation de paraffine sections par déparaffinage, l'hydratation en utilisant un gradient d'alcool, la récupération d'antigène de la chaleur induite, et le blocage de l'activité peroxydase endogène et non spécifiques des sites de liaison. Certaines coupes sont ensuite colorées avec des anticorps spécifiques pour le marqueur de cellules T CD8 et tandis que d'autres sont colorées pour la tyrosine hydroxylase. Les lames sont ensuite traitées avec des anticorps appropriés secondaire conjugué à la biotine, puis développé en utilisant de l'avidine-peroxydase conjugué de raifort (HRP) avec Diaminiobenzidine (DAB) comme substrat. Après développement, les diapositives sont contre pour le contraste, et montées sous lamelles avec Permount. Après un séchage adéquat, ces lames sont ensuite prêtes pour l'imagerie.

Protocol

Coloration des coupes à la paraffine

1. Déparaffinage diapositives avec du xylène (Fisher X3 ^S -4) 3x pendant 5 minutes chacun (xylène changent chaque mois selon l'utilisation, le xylène est toxique). Utilisez de la vaisselle et les couvertures pour 20 diapositives de Fisher ref 08-812-1A et étagères faites pour s'adapter à ces plats. 200 ml de liquide par plat.
2. Hydrater par gradient de l'alcool comme suit (changement de gradient toutes les 2 semaines):
   • 2x dans l'éthanol 100% (Fisher # A406-20) pendant 2 min de chaque
   • 2x dans l'éthanol 95% pendant 2 min de chaque
   • 1x dans l'éthanol 70% pendant 2 min
   • 1x dans l'éthanol 50% pendant 2 min
   • 1x dans l'éthanol 30% pendant 2 min
   • 1x ddH ₂ O pendant 2 min
3. Faire tremper dans du DPBS pendant 5 min (DPBS = phosphate de Dulbecco modifié saline tamponnée avec du Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +).}

La récupération Antigène:

1. Préchauffer le tampon Na-citrate (10 mM, pH 6,5) dans le micro-ondes.
2. Cuire les diapositives pendant 15 min au micro-ondes. Les diapositives doivent jamais à sec afin de vérifier toutes les minutes et ajouter Na-citrate, si nécessaire.
3. Laissez refroidir à température ambiante.
4. Bloquer l'activité peroxydase endogène avec 1% de H ₂ O ₂ dans DPBS pendant 20 min (1,5 ml de bouillon de 30% Sigma H-1009 dans DPBS 50 ml).
5. Faire tremper dans du DPBS 3 x 5 min.
6. Bloc des sites non spécifiques par incubation une nuit à +4 ° C dans du DPBS + 5% de sérum albumine bovine (BSA) + 0,1% de Na azide + 5% de sérum.
   
   Remarque: Le choix de sérum dépendra de l'espèce dans laquelle des anticorps utilisés pour la coloration ont été faites. Bloc avec le sérum de l'espèce dans laquelle le secondaire Ab (conjugué à la biotine) a été faite. Si ce n'est pas disponible, l'utilisation de sérum provenant d'une espèce différente de celle dans laquelle l'Ac primaire a été rendu.
   
   
7. Bloquer les sites de la biotine avec le kit avidine / biotine blocage (Vector Laboratories catalogue # SP-2001):
   • Incuber avec l'avidine D pendant 15 min. Rincer brièvement avec DPBS.
   • Incuber avec la solution de biotine pendant 15 min.
8. Incuber dans l'enseignement primaire Ab pendant 2 heures à température ambiante, dans DPBS + 2% de BSA + 0,1% + NaAzide 2% de sérum (le même que pour le blocage étape).
9. Faire tremper dans du PBS 3 x 5 min.
10. Incuber avec l'Ab secondaire conjugué à la biotine pendant 1 heure à température ambiante dans DPBS + 2% de BSA + 0,1% Na azide + 2% de sérum (le même que celui utilisé pour l'étape de blocage).
11. Préparer le réactif ABC dans le même temps, car elle doit se développer pendant au moins 30 min avant de les utiliser! (Voir Matériaux)
12. Préparer dans un tube conique de 50 ml. En DPBS 15 ml (pas de sérum, aucun azoture) ajoutez 3 gouttes de réactif A, mélangez et ajoutez 3 gouttes de réactif B et mélanger. Ne pas tordre les bouteilles, au lieu d'attendre pour les gouttes pour former par leurs propres moyens. ABC kit PK-6100 Vectastain de Vector Labs.
13. Faire tremper dans du DPBS 3 x 5 min.
14. Incuber avec le réactif ABC pendant 30-45 min à température ambiante.
15. Faire tremper dans du DPBS 3 x 5 min.
16. Préparer substrat de la peroxydase DAB (Vector Labs # SK-4100) dans 5 ml ddH O ₂ dans un flacon en verre juste avant son utilisation (voir Matériaux)
    • 2 gouttes de solution de stock tampon, mélanger
    • 4 gouttes de DAB, mélanger (devrait devenir légèrement brun)
    • 2 gouttes de H ₂ O _2, mélanger
17. Déposer le substrat DAB au sommet de la glisse et de regarder pour la coloration brune.
18. Trempez glisse dans la glace + eau du robinet pour arrêter la réaction.
19. Rincer sous l'eau froide du robinet pendant 5 min.
20. Contre à l'hématoxyline (20 sec; Fisher CS401-D) et rincer à l'eau du robinet jusqu'à l'eau sort claire.
21. Déshydrater dans l'alcool à partir de gradient éthanol à 30% jusqu'à 100% d'éthanol (2 minutes chacun).
22. Faire tremper dans du xylène 3 x 5 min.
23. Monter avec Permount (Fisher # SP15-100): mettre un peu au-dessus de la section sur la diapositive et appuyez lentement sur la section d'une lamelle, sans bulles d'air. Ne pas déplacer la lamelle jusqu'à séchage complet, qui prend environ 24 heures.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Use to make EtOH gradient.
DPBS			Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+
Na-Citrate buffer			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	30% stock => Dilute to 1% in DPBS
Blocking solution			DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum.
BSA
Sodium Azide			NaAzide
avidin/biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2001
Ab buffer			DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)
ABC kit Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin	Fisher Scientific	CS401-D	counterstain
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Slides and cover-slips			glass