Summary
Abstract
Immunohistochemistry (आईएचसी) एक मूल्यवान स्थानीयकरण / एक घुड़सवार ऊतक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग अनुभाग में प्रोटीन अभिव्यक्ति की कल्पना का उपयोग तकनीक है. वहाँ दो तरीके हैं: प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष विधि. इस प्रयोग में, हम केवल अप्रत्यक्ष आईएचसी धुंधला के उपयोग का वर्णन करेंगे. अप्रत्यक्ष आईएचसी धुंधला अत्यधिक विशिष्ट प्राथमिक और बायोटिन - संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल. प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए कड़ाई से ब्याज की एक विशिष्ट मिलान करने के लिए बंधन से प्रोटीन की पहचान है, जबकि माध्यमिक एंटीबॉडी गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला के लिए घटाना और प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए परिसरों द्वारा निर्मित संकेत बढ़ाना करने के लिए उपयोग कर रहे हैं. स्लाइड या तो जमे हुए वर्गों से उत्पन्न किया जा सकता है, या आयल एम्बेडेड वर्गों गिलास स्लाइड पर घुड़सवार. इस प्रोटोकॉल में, हम dewaxing, जलयोजन एक शराब ढाल का उपयोग कर, गर्मी प्रेरित प्रतिजन पुनर्प्राप्ति, और अंतर्जात peroxidase की गतिविधि और गैर विशिष्ट बाध्यकारी साइटों के अवरुद्ध द्वारा आयल - एम्बेडेड वर्गों की तैयारी पर चर्चा की. कुछ वर्गों तो टी सेल मार्कर सीडी 8 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं और जबकि दूसरों tyrosine hydroxylase के लिए दाग रहे हैं. स्लाइड्स बाद में उपयुक्त माध्यमिक बायोटिन को संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ व्यवहार कर रहे हैं, तो सब्सट्रेट के रूप में Diaminiobenzidine (थपका) के साथ avidin संयुग्मित हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) का उपयोग करने के लिए विकसित. विकास के बाद, स्लाइड विपरीत के लिए counterstained हैं, और permount साथ coverslips के तहत मुहिम शुरू की. पर्याप्त सूखने के बाद, इन स्लाइड्स तो इमेजिंग के लिए तैयार हैं.
Protocol
आयल वर्गों का धुंधला
- Dewax Xylene (फिशर X3 -4 एस) 5 मिनट के लिए 3x के साथ स्लाइड (परिवर्तन xylene हर महीने के उपयोग पर निर्भर करता है, xylene विषैला होता है ). फिशर 08-812-1A रेफरी और रैक से 20 स्लाइड्स के लिए बर्तन का प्रयोग करें और कवर करने के लिए इन व्यंजनों फिट बनाया है. पकवान प्रति 200 मिलीलीटर तरल.
- प्रकार (ढाल बदलने के हर 2 सप्ताह) के रूप में शराब ढाल के माध्यम से हाइड्रेट:
- 2 मिनट प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल (फिशर # A406-20) में 2x
- 2 मिनट प्रत्येक के लिए 95% इथेनॉल में 2x
- 1x 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में
- 1x 2 मिनट के लिए 50% इथेनॉल में
- 1x 2 मिनट के लिए 30% इथेनॉल में
- 2 मिनट के लिए 1x DDH 2 हे
- 5 मिनट के लिए DPBS में लेना (DPBS = Dulbecco संशोधित फास्फेट Ca 2 के साथ खारा buffered + और मिलीग्राम 2 +) .
एंटीजन वसूली:
- माइक्रोवेव में पूर्व गर्मी ना साइट्रेट बफर (10 मिमी, पीएच 6.5).
- स्लाइड्स को माइक्रोवेव में 15 मिनट के लिए कुक. स्लाइड्स तो हर मिनट की जाँच करें और जोड़ ना - साइट्रेट जब आवश्यक कभी नहीं सूखी चाहिए.
- कमरे के तापमान पर शांत करते हैं.
- % 1 DPBS में 20 मिनट के लिए एच 2 2 हे (30% शेयर के 1.5 मिलीलीटर सिग्मा 50 मिलीलीटर DPBS में एच १,००९) के साथ अंतर्जात peroxidase गतिविधि ब्लॉक
- DPBS 3 एक्स 5 मिनट में भिगोएँ.
- 4 ° DPBS सी + 5% गोजातीय सीरम albumin (BSA) + 0.1% ना azide + 5% सीरम पर रातोंरात incubating द्वारा गैर - विशिष्ट साइटों को ब्लॉक.
नोट: सीरम के विकल्प प्रजातियों में जो धुंधला के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी किए गए थे पर निर्भर करेगा. प्रजातियों जिसमें माध्यमिक अब (संयुग्मित बायोटिन) बनाया गया था से सीरम के साथ ब्लॉक. यदि यह उपलब्ध नहीं है, जिसमें प्राथमिक अब बनाया गया था से विभिन्न प्रजातियों में से एक सीरम का उपयोग करें.
- Avidin / बायोटिन अवरुद्ध किट (वेक्टर प्रयोगशालाओं सूची # SP-2001) के साथ बायोटिन साइटों को ब्लॉक करें:
- Avidin डी के साथ 15 मिनट के लिए सेते हैं. DPBS के साथ संक्षिप्त कुल्ला.
- बायोटिन समाधान के साथ 15 मिनट के लिए सेते हैं.
- कमरे के तापमान पर 2 बजे, DPBS में + 2% BSA + 0.1% + NaAzide 2 सीरम% (कदम अवरुद्ध करने के लिए के रूप में एक ही) के लिए प्राथमिक अब में सेते हैं.
- पीबीएस 3 एक्स 5 मिनट में भिगोएँ.
- माध्यमिक अब 1 घंटे के लिए बायोटिन साथ DPBS में कमरे के तापमान + 2% BSA + 0.1% ना azide + 2 सीरम% (अवरुद्ध कदम के लिए उसी के रूप में इस्तेमाल किया). संयुग्मित के साथ सेते
- क्योंकि यह प्रयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए विकसित किया है एक ही समय में एबीसी अभिकर्मक तैयार! (सामग्री देखें)
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में तैयार. 15 मिलीलीटर DPBS में (कोई सीरम, कोई azide) अभिकर्मक के 3 बूँदें जोड़ने ए, मिश्रण और अभिकर्मक बी और मिश्रण के 3 बूँदें जोड़ें. बोतलें फैलाएंगे से बचें, बल्कि बूंदों के लिए प्रतीक्षा करने के लिए अपने दम पर फार्म. वेक्टर लैब्स से एबीसी किट पीके 6100 Vectastain.
- DPBS 3 एक्स 5 मिनट में भिगोएँ.
- एबीसी अभिकर्मक के साथ कमरे के तापमान पर 30-45 मिनट के लिए सेते हैं.
- DPBS 3 एक्स 5 मिनट में भिगोएँ.
- तैयार थपका peroxidase सब्सट्रेट (वेक्टर लैब्स # एसके-4100) 5 मिलीलीटर DDH 2 हे में एक कांच की शीशी में तुरंत उपयोग करने से पहले (सामग्री देखें )
- बफर स्टाक के समाधान के 2 बूँदें मिश्रण,
- थपका के 4 बूँदें, मिश्रण (थोड़ा भूरा हो जाना चाहिए)
- 2 बूँदें एच 2 2 हे, मिश्रण
- स्लाइड के शीर्ष पर थपका सब्सट्रेट ड्रॉप और भूरे रंग धुंधला हो जाना के लिए घड़ी.
- बर्फ में डुबकी स्लाइड्स + की प्रतिक्रिया को रोकने के नल का पानी.
- 5 मिनट के लिए ठंडे पानी के नल के नीचे कुल्ला.
- Hematoxylin (20 सेकंड, फिशर CS401 - डी) के साथ Counterstain और नल के पानी में कुल्ला जब तक पानी बाहर साफ आता है.
- शराब ढाल 30% इथेनॉल पर 100% इथेनॉल (2 मिनट प्रत्येक) शुरू करने के लिए के माध्यम से निर्जलीकरण.
- Xylene 3 एक्स 5 मिनट में भिगोएँ.
- Permount के साथ माउंट (फिशर # SP15-100): स्लाइड पर अनुभाग के ऊपर कुछ डाल दिया है और हवा बुलबुले के बिना coverslip साथ अनुभाग पर धीरे धीरे प्रेस. जब तक पूरी तरह से सूखे coverslip ले जाते हैं, जो ~ 24 घंटे लगते हैं मत करो.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC. |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Use to make EtOH gradient. |
| DPBS | Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+ | ||
| Na-Citrate buffer | 10 mM, pH 6.5 | ||
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | 30% stock => Dilute to 1% in DPBS |
| Blocking solution | DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum. | ||
| BSA | |||
| Sodium Azide | NaAzide | ||
| avidin/biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2001 | |
| Ab buffer | DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step) | ||
| ABC kit Vectastain PK-6100 | Vector Laboratories | ||
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| ddH2O | |||
| Hematoxylin | Fisher Scientific | CS401-D | counterstain |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Slides and cover-slips | glass |
