Immunohistokemi: Paraffinsnitt Använda Vectastain ABC Kit från Vector Labs

Summary

Abstract

Immunohistokemi (IHC) är en värdefull teknik som används för att lokalisera / visualisera protein uttryck i en monterad vävnad avsnitt med hjälp av specifika antikroppar. Det finns två metoder: direkta och indirekta metoden. I detta experiment kommer vi att beskriva endast användningen av indirekta IHC färgning. Indirekt IHC färgning använder mycket specifika primära och biotin-konjugerade sekundära antikroppar. Primära antikroppar utnyttjas för att diskret identifiera proteiner av intresse genom att binda till en viss epitop, medan sekundära antikroppar subtrahera för icke-specifik bakgrundsfärgning och förstärka signalen genom att bilda komplex med den primära antikroppen. Diabilder kan antingen genereras från frysta snitt eller paraffininbäddad delar monterade på glas diabilder. I detta protokoll diskuterar vi utarbetandet av paraffininbäddade sektioner genom avvaxning, hydrering med hjälp av en alkohol gradient, värme-inducerad antigenåtervinning, och blockering av endogen peroxidas aktivitet och icke-specifika bindningsställen. Vissa delar är sedan färgas med antikroppar mot T-cell markör CD8 och medan andra färgas för tyrosin hydroxylas. Bilderna därefter behandlas med lämpliga sekundära antikroppar konjugerade till biotin, därefter utvecklat utnyttjar avidin-konjugerade pepparrotsperoxidas (HRP) med Diaminiobenzidine (DAB) som substrat. Efter utveckling är bilderna counterstained för kontrast, och monteras under täckglas med permount. Efter tillräcklig torkning, dessa bilder är sedan redo för avbildning.

Protocol

Färgning av paraffin

1. Dewax diabilder med xylen (Fisher X3 ^S -4) 3x i 5 minuter vardera (ändra xylen varje månad beroende på användning, xylen GIFTIGT). Använd rätter och överdrag för 20 diabilder från Fisher ref 08-812-1A och rack för att passa dessa rätter. 200 ml vätska per maträtt.
2. Hydrate genom alkohol gradient enligt följande (ändra lutningen var 2 veckor):
   • 2x i 100% etanol (Fisher # A406-20) i 2 minuter varje
   • 2x i 95% etanol i 2 min varje
   • 1x i 70% etanol i 2 min
   • 1x i 50% etanol i 2 min
   • 1x i 30% etanol i 2 min
   • 1x DDH ₂ O i 2 min
3. Blötlägg i DPBS i 5 min (DPBS = Dulbecco ändrade Fosfatbuffrad saltlösning med Ca ^{2 +} och Mg ^{2 +).}

Antigen återhämtning:

1. Förvärmning av Na-citratbuffert (10 mM, pH 6,5) i mikrovågsugn.
2. Koka bilderna i 15 min i mikrovågsugnen. Bilderna bör aldrig torka så kolla varje minut och tillsätt Na-citrat vid behov.
3. Låt svalna i rumstemperatur.
4. Blockera endogen peroxidas-aktivitet med 1% H ₂ O ₂ i DPBS i 20 minuter (1,5 ml 30% lager Sigma H-1009 i 50 ml DPBS).
5. Blötlägg i DPBS 3 x 5 min.
6. Blockera icke-specifika webbplatser genom att inkubera över natten vid 4 ° C i DPBS + 5% bovint serumalbumin (BSA) + 0,1% Na Azid + 5% serum.
   
   Obs: Val av serum beror på arter där antikroppar används för färgning gjordes. Blockera med serum från de arter där den sekundära Ab (konjugerad till biotin) gjordes. Om detta inte är tillgängligt, använder serum från en annan art än den där de primära Ab gjordes.
   
   
7. Blockera biotin webbplatser med avidin / biotin blockering kit (Vector laboratorier katalog # SP-2001):
   • Inkubera med Avidin D i 15 min. Skölj kort med DPBS.
   • Inkubera med biotin lösningen i 15 min.
8. Inkubera i obearbetad Ab för 2 timmar i rumstemperatur, i DPBS + 2% BSA + 0,1% NaAzide + 2% serum (samma som för blockering steg).
9. Blötlägg i PBS 3 x 5 min.
10. Inkubera med den sekundära Ab konjugerat med biotin i 1 timme i rumstemperatur i DPBS + 2% BSA + 0,1% Na Azid + 2% serum (samma som används för att blockera steget).
11. Förbered ABC reagens på samma gång eftersom det har att utvecklas i minst 30 min före användning! (Se Material)
12. Förbered i en 50 ml koniska rör. I 15 ml DPBS (inget serum, ingen azide) Tillsätt 3 droppar av reagens A, blanda och tillsätt 3 droppar reagens B och blanda. Undvik att klämma på flaskorna, i stället vänta på dropparna att bilda på egen hand. ABC kit Vectastain PK-6100 från Vector Labs.
13. Blötlägg i DPBS 3 x 5 min.
14. Inkubera med ABC reagens i 30-45 minuter i rumstemperatur.
15. Blötlägg i DPBS 3 x 5 min.
16. Förbered DAB peroxidas substrat (Vector Labs # SK-4100) i 5 ml DDH ₂ O i en glasflaska omedelbart före användning (se Material)
    • 2 droppar buffertlager lösning, blandning
    • 4 droppar DAB, mix (ska bli något brun)
    • 2 droppar H ₂ O _2, blanda
17. Släpp DAB substrat ovanpå bilderna och titta på bruna fläckar.
18. Doppa objektglasen i is + kranvatten för att stoppa reaktionen.
19. Skölj under kallt kranvatten i 5 min.
20. Motfärga med hematoxylin (20 sek; Fisher CS401-D) och skölj i kranvatten tills vatten kommer ut klart.
21. Torka genom alkohol lutning från 30% etanol upp till 100% etanol (2 min vardera).
22. Blötlägg i xylen 3 x 5 min.
23. Montera med Permount (Fisher # SP15-100): sätta några ovan avsnittet om bilden och trycker sakta in på avsnitt med ett täckglas utan luftbubblor. Flytta inte täckglas tills helt torrt, vilket tar ~ 24 timmar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Use to make EtOH gradient.
DPBS			Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+
Na-Citrate buffer			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	30% stock => Dilute to 1% in DPBS
Blocking solution			DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum.
BSA
Sodium Azide			NaAzide
avidin/biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2001
Ab buffer			DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)
ABC kit Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin	Fisher Scientific	CS401-D	counterstain
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Slides and cover-slips			glass