Summary
Um
Abstract
A maioria das mortes por malária humana é causada por parasitas do sangue estágio Plasmodium falciparum. Malária cerebral, a complicação mais risco de vida da doença, é caracterizada por um acúmulo de Plasmodium falciparum glóbulos vermelhos infectados (iRBC) na fase trofozoíto pigmentada na microvasculatura do cérebro 2-4. Esta obstrução microvascular (seqüestro) leva à hipóxia, acidose e prejudiciais citocinas inflamatórias (revisto em 5). Seqüestro também é encontrado na maioria dos tecidos microvascular do corpo humano 2, 3. O mecanismo pelo qual iRBC anexar às paredes dos vasos sanguíneos é ainda mal compreendida.
O imortalizado Human Brain microvascular linhagem de células endoteliais (HBEC-5i) tem sido usado como um modelo in vitro da barreira hemato-encefálica 6. No entanto, o Plasmodium falciparum iRBC anexar apenas mal ao HBEC-5i in vitro, ao contrário do sequestrat densaion que ocorre em casos de malária cerebral. Por isso, desenvolveu um ensaio panning para selecionar (enriquecer) p. vários cepas falciparum para adesão ao HBEC-5i, a fim de obter populações de alto-binding parasitas, mais representativa do que ocorre in vivo.
Uma amostra de uma cultura parasita (mistura de RBC iRBC e não infectadas) na fase de trofozoíto pigmentada é lavado e incubado em uma camada de HBEC-5i cultivados em uma placa de Petri. Após a incubação, o prato é cuidadosamente lavado e livre de uRBC iRBC desacoplado. URBC fresco são adicionadas ao iRBC alguns anexados a HBEC-5i e incubadas durante a noite. Como parasitas estágio esquizonte estourar, merozoítos reinvade RBC e estes parasitas estágio anel são colhidas no dia seguinte. Parasitas são cultivadas até material suficiente é obtida (geralmente 2 a 4 semanas) e uma nova rodada de seleção pode ser realizada. Dependendo do P. falciparum tensão, 4-7 rodadas de seleção são necessários a fim de obter uma populaçãoonde a maioria dos parasitas se ligam a HBEC-5i. O fenótipo de ligação é progressivamente perdida depois de algumas semanas, indicando uma mudança na expressão do gene variante antígeno de superfície, assim, a seleção regulares sobre HBEC-5i é necessária para manter o fenótipo.
Em resumo, nós desenvolvemos um ensaio de renderização seleção P. parasitas falciparum uma forma mais "cerebral da malária adesivo" fenótipo. Fomos capazes de selecionar 3 de 4 p. cepas falciparum em HBEC-5i. Este ensaio também tem sido usados com sucesso para selecionar os parasitas para a ligação com humanos dérmica e pulmonar de células endoteliais. Importante, este método pode ser usado para selecionar populações de tecidos específicos do parasita, a fim de identificar ligantes do parasita candidato para a ligação ao endotélio cerebral. Além disso, este ensaio pode ser utilizado para triagem de suposto seqüestro de anti-drogas 7.
Protocol
Recomendações gerais
Cérebro humano microvascular cultura de células endoteliais (HBEC-5i) tem sido descrito anteriormente em 6, 8. P. parasitas falciparum foram cultivadas como no 9. Ambos HBEC-5i e P. culturas falciparum parasita devem ser mantidos em condições estéreis em todos os momentos. Todos os reagentes devem ser pré-aquecido a 37 ° C. Recomendamos que verifique regularmente se há contaminação por micoplasma 10 por PCR (Minevera Biolabs, as instruções do fabricante do seguinte). O protocolo está resumida na Figura 1.
1. Cultura de rotina da célula endotelial
- Prepare os reagentes necessários.
| Médio para se preparar | Reagentes | Quantidade |
| "DMEM incompleto" | DMEM-F12 Ham | 500ml |
| | L-glutamina 200mM | 5ml |
| Penicilina estreptomicina / 100X | 5 ml | |
| NaOH 1M | 1,3 ml (ajustar o pH a 7.4) | |
| "DMEM completo" | "DMEM incompleto" | 450ml |
| Fetal bovino soro inativado pelo calor | 50ml | |
| Suplemento de crescimento da célula endotelial | 5 ml |
- Cultura HBEC-5i num frasco de 25 centímetros 2 perfurada com 10ml meio DMEM completo em um 37 ° C incubadora com 5% de CO 2.
- Células passagem quando eles se tornam confluentes. Remover o meio de idade por sucção e lavar duas vezes com DMEM incompleta ou cultura de tecidos grau PBS (Ca 2 + e Mg 2 + livre) pré-aquecido a 37 ° C.
- Adicionar 1 ml de pré-aquecido Tentepsin-EDTA (0,025% Tripsina, 0,5 mM EDTA), agite para cobrir a totalidade do frasco e incubar por ~ 2 min a 37 ° C.
- Seleção em microscópio invertido que pelo menos 90% das células foram destacados. Se necessário, delicadamente bater o fundo do frasco para retirar células aderentes. Adicionar 10 ml de meio completo DMEM para impedir as células de tripsina e transferir para um tubo cônico 15ml. Centrifugar por 4 min a 300 g à temperatura ambiente (RT).
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet com 10 ml de meio completo DMEM. Pipeta a solução cima e para baixo completamente ressuspender as células.
- Adicionar 1 ou 2 ml da suspensão de células para um balão nova cultura e adicione 8ml de meio fresco para manter a cultura. Avaliar o crescimento da cultura todos os dias sob um microscópio invertido e mudança de médio a cada 2 ou 3 dias antes que ele fica amarelo.
2. Preparar células endoteliais para uma seleção
- Dois dias antes do dia da seleção e n, adicione fibronectina diluído em PBS estéril (2 mg / cm 2) em um (ou mais) 60 mm placa de Petri. Incubar o prato por 5 a 20 min a 37 ° C, em seguida, remova a solução fibronectina, que pode ser armazenado a 4 ° C por um mês e re-utilizado uma vez.
- Células passagem como descrito nas seções 1.3. para 1,5. Assumindo 100% de células confluentes foram destacados e ressuspenso em 10ml meio DMEM completo (seção 1.6., Ressuspender com um volume equivalente de médio se a confluência é menor, por exemplo, ressuspender com 8ml se a confluência foi de 80%), adicionar 1,5 ml da suspensão células à placa de Petri revestidas fibronectina e outro de 1,5 ml de meio completo DMEM.
- Coloque a placa de Petri semeadas na incubadora. Nota: Idealmente, a confluência será em torno de 90% no momento da seleção dois dias depois.
- Opcional. Para ativar HBEC-5i, adicione o TNF de citocina (fator de necrose tumoral) em uma concentração final de 50μg/ml 24 horas antes da seleção.
- Prepare os reagentes necessários (veja a tabela aqui abaixo). Prepare células vermelhas do sangue (RBC), separando sangue total (grupo O +) pela passagem através de um filtro de remoção de leucócitos (ver "Métodos de Pesquisa em Malária" publicação 11 para cultura geral parasitas da malária). Lavar RBC duas vezes por centrifugação a 400 g por 5 min e ressuspensão com 10 ml RPMI incompleta. Mantenha RBC lavado a 4 ° C em meio incompleta em hematócrito de 50%.
| Médio para se preparar | Reagentes | Quantidade |
| "RPMI incompleto" | RPMI 1640 (com bicarbonato) | 500ml |
| Hepes 1M | 12.5ml | |
| Glicose a 20% | 5ml | |
| L-glutamina 200mM | 5ml | |
| Gentamicina 50mg/ml | 250μl | |
| NaOH 1M | 0,7 ml (ajustar o pH a 7.2) | |
| "RPMI completo" | "RPMI incompleto" | 450ml |
| Agrupados humano (não imunes) de soro | 50ml |
- Cultura P. falciparum infectados RBC com meio completo RPMI a 37 ° C com 3% de CO 2, 1% O 2, e 96% N 2. hematócrito em 2% e incubar Faça Giemsa esfregaço 11 diárias para avaliar o estágio de desenvolvimento de parasitas (Figura 2).
- Regularmente (aproximadamente uma vez por semana) sincronizar cultura por tratamento sorbitol 12. O dia antes do ensaio da selecção, objectivo para uma cultura anel de estágio na parasitemia 5% ou mais (de preferência pelo menos 10%).
4. Seleção de P. falciparum para cytoadhesion às células endoteliais
- No dia do ensaio, a cultura deve ser parasita na fase trofozoíto pigmentados (Figura 2) (idealmente parasitemia 10%), enquanto HBEC-5i cultura deve ser de 50 a 100% confluência (idealmente 90%). Volume celular 30μl repleta de cultura parasita é necessário por HBEC-5i placa de Petri.
- Lavar parasitas duas vezes por centrifugação (500 g por 5 min) 1,5 ml da cultura parasita. Elimine o sobrenadante e ressuspender com 10ml de preparados na hora, aquecido meio DMEM, incompleta. Repita a lavagem pela segunda vez. Ressuspender o volume celular 30μl embalado com 1,5 ml de DMEM incompleta com BSA 1%.
- Lave o HBEC-5i placa de Petri revestidas por duas vezes aspiração médio e adicionando 3 ml de DMEM incompleta.
- Adicionar a solução de parasitas para o prato HBEC-5i e incubar a 37 ° C por 75min. Ressuspender parasitas duas vezes (aos 30 e 60 min) durante a incubaçãosuavemente balanço o prato nas quatro direções, bem como no sentido horário e anti-horário.
- Após a incubação, lavar o prato 5 vezes por meio de aspiração, usando um plástico Pasteur pipeta para adicionar 3 ml de meio DMEM quente incompleta, e de balanço suave. Se muitos pratos estão sendo utilizados, mantê-los em uma superfície quente, como um grande frasco cheio de água a 37 ° C.
- Verifique o prato sob um microscópio invertido. Se muitos RBC não infectados ainda são visíveis, não lava mais como descrito acima. Lidar com a placa de Petri com muito cuidado para evitar qualquer risco de contaminação.
- Remova o meio do prato e adicionar 3 ml de meio RPMI quente completo com volume celular 40μl repleta de uRBC fresco.
- Coloque o prato em uma câmara hermética de incubação, o gás por 3 min e colocar a câmara em uma incubadora a 37 ° C durante a noite.
- No dia seguinte, colher os parasitas por lavagem com RPMI médio incompletos, de um modo semelhante ao descrito na seção 4.4. mas de forma mais vigorosa. Keep todos usados médio (contendo ressuspenso RBC) em um tubo de 15ml cônico. Seleção em microscópio invertido que todos RBC foram removidos do prato.
- Pellet os parasitas, desprezar o sobrenadante, ressuspender em meio RPMI 5ml completo e coloque a mistura em um frasco de cultura normal.
5. Resultados representante
Parasitas não selecionados mostram um baixo nível de ligação a HBEC-5i (Figura 3A). Assim, após a primeira rodada de seleção, os parasitas poucos serão colhidos e pode demorar até um mês de cultura para chegar a uma parasitemia suficiente para a segunda rodada de seleção. Após cada rodada de seleção, mais parasitas e mais se ligam a células endoteliais e as seleções pode ser repetido em intervalos de tempo mais curto. Após 4-5 rodadas de seleção, as populações de alta ligação parasita são obtidos (Figura 3).
Em nossas mãos, a ligação de HB3-HBEC para HBEC-5i ou ativado HBEC TNF-5i era de simhomólogos de nível (dados não mostrados).
O protocolo descrito aqui foi testado com 4 p. cepas falciparum: HB3, IT/FCR3, 3d7 e DD2 (Tabela 1). Apenas o último não provou ser capaz de se ligar a HBEC-5i, mesmo depois de cinco rodadas de seleção.
HB3 parasitas também foram selecionados para a citoaderência Humanos dérmica e pulmonar células endoteliais microvasculares (HDMEC e HPMEC). Após 4 rodadas de seleção, usando o método descrito aqui, uma população de alto-binding foi obtido em ambos os HDMEC e HPMEC (Figura 4).
Figura 1. Visão geral do processo de seleção.
Estágios figura 2. Desenvolvimento de P. falciparum glóbulos vermelhos infectados. Esfregaço Giemsa visualizados sob microscópio com ampliação de 1000X.
Figura 3. Exemplo típico de parasitas ligação a HBEC-5i. (A) A camada azul é HBEC-5i fixado em glutaraldeído e corados com Giemsa, visualizados sob microscópio com ampliação de 1000X. Fotos foram tiradas após uRBC e iRBC unbound foram lavados. O painel esquerdo mostra um único P. falciparum HB3 (não selecionados) parasita obrigado a HBEC-5i. No painel direito os parasitas HB3-HBEC tinha sido seleccionado para cinco rounds. (B) Os dados representam a média de dois experimentos independentes, cada uma realizada em duplicata. O número de parasitas obrigados por célula endotelial foi contado.
Tabela 1. Resumo das cepas de Plasmodium falciparum que foram selecionados com sucesso para a ligação com HBEC Nota-5i. HB3 que também foi selecionado no TNF-activated HBCE-5i. Após 5 rodadas de seleção, a tensão DD2 não mostrou aumento na ligação para HBEC-5i comparação com unselected-DD2.
Figura 4. Ligação do P. falciparum HB3 parasitas para dérmica (HDMEC) e pulmonar (HPMEC) células endoteliais, antes e depois de quatro rodadas de seleção. Embora o meio de cultura para HDMEC e HPMEC ligeiramente diferente (veja as instruções do fornecedor), o protocolo usado para a seleção foi idêntica como com HBEC-5i. Fotos tiradas com ampliação de 400X.
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| DMEM-F12 Ham | Sigma | D6421 | Por meio completo DMEM |
| L-glutamina 200mM | GIBCO | 25030 | Para DMEM e meio completo RPMI |
| Penicilina estreptomicina / 100X (10.000 unidades / ml e 10mg/ml) | ScienCell | 0503 | Por meio completo DMEM |
| Fetal bovino soro inativado pelo calor | ScienCell | 0025 | Por meio completo DMEM |
| Tripsina-EDTA (0,025% Tripsina, 0,5 mM EDTA) | ScienCell | 0103 | |
| Suplemento de crescimento da célula endotelial | ScienCell | 1052 | Por meio completo DMEM |
| Cultura de tecidos tratados 60 milímetros X 15 milímetros placas de Petri | BD | 353002 | |
| A fibronectina humana | Millipore | FC010 | Use a 2 mg / cm 2 |
| TNF | R &D Systems | 210-TA | opcional, use a 50 mg / ml |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167f | Por meio completo RPMI |
| Gentamicina 50mg/ml | Lonza | 17-518Z | Por meio completo RPMI |
| Hepes 1M | Lonza | BE17-737E | Por meio completo RPMI |
| HDMEC | ScienCell | 2000 | Linhagem de células primárias |
| HPMEC | ScienCell | 3000 | Linhagem de células primárias |
| HBEC-5i | Obtido a partir de Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) |
Tabela 2. Materiais
Discussion
A marca da malária cerebral é o seqüestro de P. falciparum iRBC dentro do cérebro microvasculatura 2, 3. No entanto, em culturas in vitro de P. falciparum apenas mal cytoadhere para HBEC-5i, um modelo de cérebro humano endotélio microvascular. Aqui desenvolvemos um ensaio simples para enriquecer uma população para a ligação com HBEC-5i, um mais "in-vivo, como" fenótipo. Três em cada 4 p. cepas falciparum foram selecionados com sucesso usando este método. Além disso, HB3 também foi selecionado em HDMEC e HPMEC, indicando que este protocolo pode ser usado para vários tipos e parasita das células endoteliais.
Diferentes hipóteses podem explicar a falta de ligação com a cepa DD2. O mais provável é o fato de que esta linha parasita é knobless, que impede a profundamente citoaderência 13, 14.
Recomendamos parasitas cultura não selecionados ao longo do pro seleçãocesso para fornecer um controle para comparação. Isto irá permitir, por exemplo, comparando o transcriptoma de parasitas vinculativa e não vinculativa, com a esperança de descobrir candidatos ligante do parasita.
TNF é uma citocina encontrados em nível elevado em pacientes com malária cerebral e foi mostrar para induzir a expressão de proteínas de superfície muitas das HBEC-5i (Claessens et al, em preparação e 8, 15, 16). Neste caso, a quantidade de iRBC ligada foi semelhante em HBEC-5i comparação com ativado HBEC-5i.
Este "modelo de sequestro" também pode ser usado para estudar a interação molecular entre os iRBC e as células endoteliais, bem como o efeito do suposto anti-citoaderência drogas. Neste caso, recomendamos plating HBEC-5i em poços menores, tais como "slides oito bem-câmara" (BD 354628) ou "CultureWell" (Sigma C7735-20EA).
Disclosures
Não temos nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Francisco Candal, CDC Transferência de Tecnologia Escritório, Atlanta Geórgia para HBEC-5i células. Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust (4 anos bolsa de estudo para doutorado e AC Fellowship sênior em ciência biomédica básica para JAR, conceder número 084226).
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