Summary
و
Abstract
وتحدث معظم الوفيات الناجمة عن الملاريا الإنسان عن طريق الدم في مرحلة طفيليات الملاريا المنجلية. يتميز الملاريا الدماغية ، وأكثر مضاعفات تهدد الحياة من المرض ، من خلال تراكم المنجلية المصابة خلايا الدم الحمراء (iRBC) في المرحلة أتروفة الصباغية في الدماغ microvasculature 2-4. هذه العرقلة microvessel (عزل) يؤدي الى نقص الأكسجة ، الحماض والسيتوكينات الالتهابية الضارة (التي استعرضت في 5). كما توجد في معظم أنسجة تنحية الاوعية الدموية الدقيقة في جسم الإنسان 2 ، 3. لا تزال الآلية التي iRBC نعلق على جدران الأوعية الدموية غير مفهومة.
وقد استخدمت في الاوعية الدموية الدقيقة خلد الدماغ البشري غشائي خط الخليوي (HBEC - 5I) باعتبارها نموذجا في المختبر من حاجز الدم في الدماغ 6. ومع ذلك ، المتصورة المنجلية iRBC إرفاق سيئة فقط لHBEC - 5I في المختبر ، على عكس sequestrat كثيفةأيون التي تحدث في حالات الملاريا الدماغية. قمنا بتطوير بالتالي مقايسة بالغسل لتحديد (إثراء) P. مختلف سلالات المنجلية للالتصاق ل- 5I HBEC من أجل الحصول على السكان العالية ملزمة الطفيليات ، وأكثر تمثيلا لما يحدث في الجسم الحي.
يتم غسل عينة من ثقافة الطفيلي (خليط من RBC iRBC وغير مصاب) في المرحلة أتروفة المصطبغة وحضنت على طبقة من 5I - HBEC نمت على طبق بتري. بعد الحضانة ، يتم غسلها برفق الطبق خالية من uRBC iRBC وغير منضم. تضاف uRBC جديدة لiRBC القليلة المرفقة HBEC - 5I وحضنت بين عشية وضحاها. كما الطفيليات المتقسمة مرحلة الاندفاع ، ويتم حصاد merozoites reinvade RBC وهذه الطفيليات مرحلة الحلقة في اليوم التالي. تستزرع الطفيليات حتى يتم الحصول على ما يكفي من المواد (عادة 2-4 أسابيع) ويمكن إجراء جولة جديدة من التحديد. اعتمادا على P. وهناك حاجة إلى سلالة المنجلية ، من 4 إلى 7 جولات من الاختيار من أجل الحصول على مجموعة من السكانحيث ان معظم الطفيليات ربط - 5I HBEC. فقد تدريجيا النمط الظاهري ملزما بعد بضعة أسابيع ، مما يشير إلى التحول في سطح البديل مستضد التعبير الجيني ، وبالتالي مطلوب اختيار منتظمة عن HBEC - 5I للحفاظ على النمط الظاهري.
باختصار ، طورنا تقديم مقايسة اختيار P. الطفيليات المنجلية أكثر "لاصقة الملاريا الدماغية" النمط الظاهري. كنا قادرين على اختيار 3 من أصل 4 P. سلالات المنجلية - 5I على HBEC. هذا الاختبار بنجاح كما استخدمت لتحديد الطفيليات للربط إلى الخلايا البشرية البطانية الجلد والرئتين. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد السكان الطفيل أنسجة معينة من أجل تحديد المرشح ليغاندس الطفيلي ملزمة لبطانة الدماغ. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا الاختبار للكشف عن العقاقير المضادة للاحتباس المفترضة 7.
Protocol
توصيات عامة
وقد الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري البطانية الخلية (HBEC - 5I) ثقافة الموصوفة سابقا في 6 و 8. P. ومثقف الطفيليات المنجلية كما هو الحال في 9. كلا HBEC - 5I وP. يجب أن تبقى المنجلية الثقافات الطفيلي في ظروف معقمة في كل الأوقات. ينبغي أن تكون جميع الكواشف قبل حرارة بلغت 37 درجة مئوية. نوصي للتحقق بانتظام للتلوث ميكوبلازما 10 بواسطة PCR (Minevera Biolabs ، تعليمات الصانع التالية ل). وتتلخص البروتوكول في الشكل 1.
1. زراعة الخلايا البطانية الروتينية
- تحضير الكواشف اللازمة.
| المتوسطة لإعداد | الكواشف | كمية |
| "DMEM غير مكتملة" | DMEM - F12 هام | 500ml |
| &نبسب ؛ | الجلوتامين L - 200MM | 5ml |
| البنسلين / الستربتومايسين 100X | 5 مل | |
| هيدروكسيد الصوديوم 1M | 1.3 مل (ضبط درجة الحموضة إلى 7.4) | |
| "DMEM الكامل" | "DMEM غير مكتملة" | 450ml |
| Foetal المصل البقري الحرارة المعطل | 50ml | |
| تكملة نمو الخلايا البطانية | 5 مل |
- ثقافة HBEC - 5I في قارورة 25cm 2 تنفيس المتوسطة مع DMEM 10ML كاملة في الحاضنة 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2.
- خلايا مرور عندما تصبح متموجة. إزالة المتوسطة القديمة عن طريق الشفط ، ويغسل به مرتين DMEM المتوسطة ناقصة أو الأنسجة ثقافة الصف PBS (كا 2 + 2 + والمغنيسيوم مجانا) قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
- إضافة 1ml من قبل تحسنت جربpsin - EDTA (0.025 ٪ التربسين ، 0.5mM EDTA) ، دوامة لتغطية مجمل القارورة واحتضان للدقيقة 2 ~ 37 درجة مئوية.
- الاختيار تحت المجهر المقلوب التي تم فصل ما لا يقل عن 90 ٪ من الخلايا. إذا لزم الأمر ، تدق بلطف أسفل القارورة لإزاحة الخلايا الملتصقة. إضافة 10ML المتوسطة DMEM الكامل لكتلة الخلايا التربسين ونقل في أنبوب مخروطي 15ml. الطرد المركزي لمدة 4 دقائق على 300 غرام في درجة حرارة الغرفة (RT).
- تجاهل وطاف resuspend الكرية مع 10ML المتوسطة DMEM كاملة. ماصة الحل صعودا وهبوطا لresuspend بدقة الخلايا.
- إضافة 1 أو 2 مل من تعليق الخلية في قارورة ثقافة جديدة وإضافة 8ml متوسطة جديدة للحفاظ على الثقافة. تقييم نمو الثقافة كل يوم تحت المجهر المقلوب وتغير المتوسط كل يوم 2 أو 3 قبل أن يتحول إلى اللون الأصفر.
2. إعداد الخلايا البطانية لاختيار
- قبل يومين من اليوم من selectio ن ، إضافة فبرونيكتين المخفف في برنامج تلفزيوني العقيمة (2 ميكروغرام / سم 2) في واحدة (أو أكثر) 60 طبق بيتري ملم. احتضان الطبق لمدة 5 إلى 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ثم إزالة حل فبرونيكتين ، والتي يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة شهر وإعادة استخدامها مرة واحدة.
- خلايا مرور كما هو موضح في المقاطع 1.3. إلى 1.5. وعلى افتراض فصل خلايا متكدسة 100 ٪ ومعلق في وسط DMEM 10ML كاملة (القسم 1.6. ، resuspend مع حجم ما يعادل المتوسطة إذا confluency هو أقل من ذلك ، على سبيل المثال مع resuspend 8ml إذا كان confluency 80 ٪) ، إضافة 1.5ml للتعليق الخلايا إلى طبق بتري وأخرى مغلفة فبرونيكتين 1.5ml المتوسطة DMEM كاملة.
- وضع طبق بتري المصنفة في الحاضنة. ملاحظة : من الناحية المثالية ، confluency ستكون حوالي 90 ٪ في وقت الاختيار بعد ذلك بيومين.
- اختيارية. لتنشيط HBEC - 5I ، إضافة (عامل نخر الورم) TNF خلوى في تركيز النهائي من 24 ساعة قبل 50μg/ml التحديد.
- تحضير الكواشف اللازمة (انظر الجدول هنا تحت). إعداد الإنسان خلايا الدم الحمراء (RBC) عن طريق فصل الدم الكامل (المجموعة O +) من قبل المرور عبر فلتر استنفاد الكريات البيض (انظر "طرق في أبحاث الملاريا" المنشور 11 لعام الملاريا طفيليات زراعة). يغسل RBC مرتين من قبل الطرد المركزي في 400 غرام لمدة 5 دقائق وإعادة التعليق عليها مع 10 مل RPMI غير مكتملة. إبقاء RBC غسلها عند 4 في المتوسط ناقصة درجة مئوية في الهيماتوكريت 50 ٪.
| المتوسطة لإعداد | الكواشف | كمية |
| "RPMI غير مكتملة" | RPMI 1640 (مع بيكربونات) | 500ml |
| Hepes 1M | 12.5ml | |
| الجلوكوز 20 ٪ | 5ml | |
| الجلوتامين L - 200MM | 5ml | |
| الجنتاميسين 50mg/ml | 250μl | |
| هيدروكسيد الصوديوم 1M | 0.7 مل (ضبط درجة الحموضة إلى 7.2) | |
| "RPMI الكامل" | "RPMI غير مكتملة" | 450ml |
| المجمعة الإنسان (غير المناعية) مصل | 50ml |
- ثقافة P. المنجلية المصابة RBC مع RPMI الكامل في المتوسط 2 ٪ والهيماتوكريت في احتضان 37 درجة مئوية مع 3 ٪ CO 2 ، 1 ٪ O 2 ، و 96 ٪ N 2. جعل بالغيمزا مسحة 11 يوميا لتقييم مرحلة من مراحل نمو الطفيليات (الشكل 2).
- بانتظام (مرة في الأسبوع تقريبا) مزامنة الثقافة عن طريق العلاج السوربيتول 12. في اليوم السابق للمقايسة الاختيار ، والهدف من أجل ثقافة الدائري المرحلة جود الطفيليات في الدم بنسبة 5 ٪ أو أكثر (على الأقل من الناحية المثالية 10 ٪).
4. اختيار P. المنجلية لcytoadhesion إلى الخلايا البطانية
- في يوم من الفحص ، يجب أن تكون ثقافة الطفيلي في مرحلة أتروفة المصطبغة (الشكل 2) (مثالي جود الطفيليات في الدم بنسبة 10 ٪) ، في حين HBEC - 5I ثقافة ينبغي أن تكون في 50 إلى 100 ٪ confluency (مثاليا 90 ٪). وهناك حاجة 30μl حجم الخلية معبأة الثقافة الطفيلي في طبق بيتري HBEC - 5I.
- يغسل الطفيليات مرتين من قبل الطرد المركزي (500 غرام لمدة 5 دقائق) 1.5ml الثقافة الطفيلي. تجاهل وطاف مع resuspend 10ML المصنوعة حديثا ، تحسنت DMEM المتوسطة ، غير مكتملة. تكرار غسل للمرة الثانية. Resuspend 30μl في حجم الخلية محملة 1.5ml من DMEM كاملة مع جيش صرب البوسنة 1 ٪.
- غسل HBEC - 5I طبق بيتري مغلفة مرتين الشفط والمتوسطة واضاف 3ml من DMEM غير مكتملة.
- إضافة إلى حل الطفيليات الطبق HBEC - 5I واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 75min. Resuspend الطفيليات مرتين (بعد 30 دقيقة و60) أثناء الحضانةالتي تعصف بلطف الطبق في الاتجاهات الأربعة ، وكذلك في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة.
- بعد الحضانة ، وغسل الطبق 5 مرات بواسطة الشفط المتوسطة ، وذلك باستخدام البلاستيك ماصة باستور لاضافة 3 مل من المتوسط الدافئة DMEM غير مكتملة ، وهزاز لطيف. إذا كنت تستخدم الكثير من الاطباق ، والاحتفاظ بها على سطح الدافئة ، مثل قارورة كبيرة مملوءة بالماء في 37 درجة مئوية.
- الاختيار الطبق تحت مجهر مقلوب. إذا كان غير مصاب RBC كثيرة ما زالت مرئية ، بذل المزيد من يغسل كما هو موضح أعلاه. التعامل مع طبق بيتري بعناية جدا لتجنب أي مخاطر التلوث.
- إزالة متوسطة من صحن وإضافة 3ml المتوسط الدافئة RPMI كاملة مع حجم الخلية 40μl معبأة من uRBC الطازجة.
- وضع طبق في غرفة محكمة الإغلاق يحتضنها والغاز لمدة 3 دقائق ومكان الغرفة في حاضنة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- في اليوم التالي ، حصاد الطفيليات عن طريق الغسيل مع RPMI المتوسطة ناقصة ، بطريقة مشابهة كما هو موضح في القسم 4.4. ولكن بقوة أكبر. كيع استخدام جميع المتوسطة (التي تحتوي على معلق RBC) في أنبوب مخروطي 15ml. الاختيار تحت المجهر المقلوب أنه تمت إزالة جميع RBC من الطبق.
- بيليه والطفيليات ، وتجاهل طاف ، في المتوسط resuspend RPMI 5ml كاملة ووضع الخليط في قارورة لزراعة طبيعية.
5. ممثل النتائج
طفيليات غير محددة تدل على تدني مستوى ملزمة لHBEC - 5I (الشكل 3A). وهكذا ، بعد الجولة الأولى من الاختيار ، سوف تحصد الطفيليات قليلة جدا ، وأنه قد يستغرق فترة تصل الى شهر واحد من أجل التوصل إلى استزراع جود الطفيليات في الدم كافية للجولة الثانية من الاختيار. بعد كل جولة من الاختيار ، والطفيليات المزيد والمزيد من ربط الخلايا البطانية ويمكن أن يتكرر في التحديدات على فترات زمنية أقصر. 4-5 بعد جولات من الاختيار ، ويتم الحصول على السكان طفيلية عالية ملزم (الشكل 3).
في أيدينا ، كان ملزما من HB3 - HBEC لHBEC TNF - 5I او تنشيط HBEC - 5I من سيمILAR المستوى (لا تظهر البيانات).
تم اختبار بروتوكول الموصوفة هنا مع 4 P. سلالات المنجلية : HB3 ، IT/FCR3 ، و3D7 DD2 (الجدول 1). أثبت هذا الأخير فقط غير قادرة على ربط HBEC - 5I ، حتى بعد 5 جولات من الاختيار.
كما تم اختيار HB3 الطفيليات للخلايا الاوعية الدموية الدقيقة cytoadherence إلى الإنسان عن طريق الجلد والرئتين غشائي (HDMEC وHPMEC). بعد 4 جولات من الاختيار ، وذلك باستخدام الأسلوب هو موضح هنا ، تم الحصول على السكانية العالية ملزمة لكلا HDMEC وHPMEC (الشكل 4).
الشكل 1. نظرة عامة على عملية الاختيار.
الرقم 2 مراحل التنمية. ب. المنجلية المصابة خلايا الدم الحمراء. تصور بالغيمزا مسحة تحت المجهر في التكبير 1000X.
الشكل 3. مثال نموذجي من الطفيليات ملزمة ل- 5I HBEC. (أ) الطبقة الزرقاء HBEC - 5I ثابت مع غلوتارالدهيد وملطخة بالغيمزا ، تصور تحت المجهر في التكبير 1000X. تم التقاط الصور بعد غسلها وuRBC iRBC غير منضم بعيدا. اللوحة اليسرى يظهر احد P. HB3 المنجلية (غير محددة) ملزمة الطفيلي - 5I HBEC. في اللوحة اليمنى قد تم تحديد الطفيليات HB3 - HBEC لمدة 5 جولات. (ب) بيانات تمثل متوسط تجربتين مستقلة ، كل منها في تنفيذ مكررة. وقد أحصى عدد الطفيليات ملزمة لكل خلية البطانية.
الجدول 1. ملخص سلالات المنجلية التي تم اختيارها بنجاح للربط إلى ملاحظة. HBEC - 5I التي تم تحديدها أيضا HB3 على تنشيط TNF - HBEC - 5I. بعد 5 جولات من الاختيار ، وأظهرت السلالة DD2 أي زيادة في ملزمة ل- 5I HBEC مقارنة DD2 - غير محددة.
الشكل 4. تجليد P. المنجلية HB3 الطفيليات إلى خلايا (HPMEC) جلدي (HDMEC) ورئوية البطانية ، قبل وبعد 4 جولات من الاختيار. وعلى الرغم من مستنبت لHDMEC وHPMEC يختلف قليلا (انظر تعليمات المورد) ، وكان البروتوكول المستخدم لاختيار متطابقة كما هو الحال مع HBEC - 5I. الصور التي التقطت في التكبير 400X.
| اسم الكاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| DMEM - F12 هام | سيغما | D6421 | لإكمال المتوسطة DMEM |
| الجلوتامين L - 200MM | GIBCO | 25030 | لDMEM RPMI والمتوسطة كاملة |
| البنسلين / الستربتومايسين 100X (10000 وحدة / مل و10mg/ml) | ScienCell | 0503 | لإكمال المتوسطة DMEM |
| Foetal المصل البقري الحرارة المعطل | ScienCell | 0025 | لإكمال المتوسطة DMEM |
| التربسين - EDTA (0.025 ٪ التربسين ، 0.5mM EDTA) | ScienCell | 0103 | |
| تكملة نمو الخلايا البطانية | ScienCell | 1052 | لإكمال المتوسطة DMEM |
| تعامل زراعة الأنسجة 60 مم X 15 مم أطباق بتري | دينار بحريني | 353002 | |
| الإنسان [فيبرونكتين] | ميليبور | FC010 | استخدام في 2 ميكروغرام / سم 2 |
| TNF | R &D أنظمة | 210 - TA | اختيارية ، استخدم في 50 ميكروغرام / مل |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12 - 167F | لإكمال المتوسطة RPMI |
| الجنتاميسين 50mg/ml | Lonza | 17 - 518Z | لإكمال المتوسطة RPMI |
| Hepes 1M | Lonza | BE17 - 737E | لإكمال المتوسطة RPMI |
| HDMEC | ScienCell | 2000 | الابتدائية خط خلوي |
| HPMEC | ScienCell | 3000 | الابتدائية خط خلوي |
| HBEC - 5I | تم الحصول عليها من Candal فرانسيسكو (fcandal@cdc.gov) |
الجدول 2. مواد
Discussion
السمة المميزة لمرض الملاريا الدماغية هو عزل P. المنجلية iRBC داخل الدماغ microvasculature 2 ، 3. ومع ذلك ، في المختبر من الثقافات P. المنجلية فقط cytoadhere سيئة لHBEC - 5I ، نموذجا لبطانة الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري. وضعت هنا لدينا تجربة مباشرة لإثراء السكان للربط إلى HBEC - 5I ، وأكثر "في الجسم الحي ، مثل" النمط الظاهري. ثلاثة من أصل 4 P. وقد تم اختيار السلالات بنجاح المنجلية باستخدام هذا الأسلوب. علاوة على ذلك ، كما تم اختيار HB3 على HDMEC وHPMEC ، مشيرا الى انه يمكن استخدام هذا البروتوكول عن طفيلي ومختلف أنواع الخلايا البطانية.
فرضيات مختلفة قد تفسر عدم الربط مع سلالة DD2. الأكثر احتمالا هو أن هذا الخط هو knobless الطفيلي ، مما يعوق بشدة cytoadherence 13 و 14.
نوصي الطفيليات زراعة غير محددة الى جانب اختيار المواليةسيس لتوفير مراقبة للمقارنة. هذا سوف يسمح ، على سبيل المثال ، مقارنة transcriptome الطفيليات الملزمة وغير الملزمة ، على أمل اكتشاف المرشحين يجند الطفيلي.
TNF هو خلوى وجدت على مستوى عال في مرضى الملاريا الدماغية ، وقد تبين للحث على التعبير عن الكثير من البروتينات السطحية HBEC - 5I (Claessens آخرون ، في إعداد و 8 و 15 و 16). في هذه الحالة ، كان مبلغ مماثل iRBC ملزمة في الحالات العادية - 5I HBEC مقارنة تنشيط HBEC - 5I.
ويمكن أيضا هذا "النموذج تنحية" يمكن استخدامها لدراسة التفاعل بين iRBC الجزيئية والخلايا البطانية ، فضلا عن تأثير العقاقير المضادة للcytoadherence المفترضة. في هذه الحالة ، ننصح الطلاء HBEC - 5I في الآبار الصغيرة ، مثل "الشرائح الغرفة 8 جيدا" دينار بحريني (354628) أو "CultureWell" (سيغما C7735 - 20EA).
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
نشكر Candal فرانسيسكو ، منها نقل التكنولوجيا مكتب وجورجيا اتلانتا لHBEC - 5I الخلايا. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست (4 سنوات دراسية لدرجة الدكتوراه لميلان والزمالات العليا في العلوم الطبية الحيوية الأساسية لJAR ، منحة رقم 084226).
References
- Scherf, A. Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum. Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).
- MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration. Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).
- Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children. J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).
- Taylor, T. E. Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts. Nat. Med. 10, 143-145 (2004).
- van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction. Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).
- Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain. Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).
- Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications. Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).
- Xiao, L. Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells. Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).
- Corrigan, R. A., Rowe, J. A. Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum. Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).
- Rowe, J. A. Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication. Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).
- Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. (2009).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).
- Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. Cell. Microbiol. , (2009).
- Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface. J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).
- Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria. Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).
- Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum. Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).
