Summary
Ein
Abstract
Die meisten menschlichen Malaria-Todesfälle werden durch Blut-Bühne Plasmodium falciparum Parasiten verursacht werden. Zerebrale Malaria, die meisten lebensbedrohliche Komplikation der Erkrankung ist durch eine Anhäufung von Plasmodium falciparum infiziert rote Blutkörperchen (iRBC) bei pigmentierten Trophozoiten Stufe in der Mikrovaskulatur des Gehirns 2-4 aus. Diese microvessel Obstruktion (Sequestrierung) führt zu Azidose, Hypoxie und schädliche inflammatorischen Zytokinen (reviewed in 5). Sequestration ist auch in den meisten mikrovaskulären Gewebe des menschlichen Körpers 2, 3 gefunden. Der Mechanismus, durch den iRBC die Wände der Blutgefäße anzubringen ist noch weitgehend unverstanden.
Die immortalisierten Human Brain mikrovaskulären Endothel-Zelllinie (HBEC-5i) wurde als ein in vitro Modell der Blut-Hirn-Barriere 6 verwendet worden. Allerdings Plasmodium falciparum iRBC nur schlecht anbringen, um HBEC-5i in vitro, im Gegensatz zu den dichten sequestratIon, das in der zerebralen Malaria-Fälle auftritt. Wir haben deshalb eine Panning-Assay (bereichern) verschiedene P. wählen falciparum-Stämme für die Haftung auf HBEC-5i, um Populationen von High-bindenden Parasiten, repräsentativer, was in vivo zu erhalten.
Eine Probe von einem Parasiten Kultur (Mischung aus iRBC und nicht infizierten Erythrozyten) an der pigmentierten Trophozoiten Bühne wird gewaschen und auf einer Schicht aus HBEC-5i auf einer Petrischale gezüchtet inkubiert. Nach der Inkubation wird die Schale vorsichtig gewaschen frei von uRBC und ungebundenen iRBC. Frische uRBC sind die wenigen iRBC an HBEC-5i und über Nacht inkubiert aufgenommen. Als Schizonten Parasiten platzen, Merozoiten reinvade RBC und diese Ring-Parasiten geerntet werden am folgenden Tag. Parasiten sind kultiviert, bis genug Material erhalten (in der Regel 2 bis 4 Wochen) und eine neue Runde der Selektion durchgeführt werden kann. Abhängig von der P. falciparum, 4 bis 7 Runden der Selektion sind erforderlich, um eine Bevölkerung zu bekommenwo die meisten Parasiten binden HBEC-5i. Die Bindung Phänotyp ist progressiv nach ein paar Wochen verloren, was auf einen Schalter in der Variante Oberflächenantigen Genexpression, also regelmäßige Auswahl an HBEC-5i erforderlich ist, um den Phänotyp zu erhalten.
Zusammenfassend haben wir eine Auswahl Assay Rendering P. falciparum Parasiten eine "zerebrale Malaria Klebstoff" Phänotyp. Wir konnten 3 Wählen Sie aus 4 P. falciparum-Stämme auf HBEC-5i. Dieser Test hat sich auch erfolgreich verwendet worden, um Parasiten für die Bindung an menschliche Haut-und Lungenerkrankungen Endothelzellen zu wählen. Wichtig ist, dass diese Methode verwendet, um Gewebe-spezifischen Parasiten Populationen zu wählen, um Kandidaten Parasiten Liganden für die Bindung an Gehirn Endothel zu identifizieren. Darüber hinaus kann dieser Test zum Screening auf putative anti-Sequestrierung Drogen 7 verwendet werden.
Protocol
Allgemeine Empfehlungen
Menschliches Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (HBEC-5i) Kultur wurde bereits in 6 beschrieben, 8. P. falciparum Parasiten wurden in 9 kultiviert. Beide HBEC-5i und P. falciparum Parasiten Kulturen sollten in sterile Bedingungen zu jeder Zeit eingehalten werden. Alle Reagenzien sollten bei 37 ° C vorgewärmt werden Wir empfehlen, regelmäßig auf Mykoplasmen-Kontaminationen 10 durch PCR (Minevera Biolabs, folgt den Anweisungen des Herstellers) zu überprüfen. Das Protokoll ist in Abbildung 1 zusammengefasst.
1. Endothelzellen Routine Kultur
- Bereiten Sie die notwendigen Reagenzien.
| Medium zur Vorbereitung | Reagenzien | Menge |
| "DMEM unvollständig" | DMEM-F12 Ham | 500ml |
| | L-Glutamin 200 mM | 5ml |
| Penicillin / Streptomycin 100X | 5 ml | |
| NaOH 1M | 1,3 ml (pH-Wert auf 7,4) | |
| "DMEM complete" | "DMEM unvollständig" | 450ml |
| Fetale Bovine Serum hitzeinaktiviertem | 50ml | |
| Endothelzellwachstum ergänzen | 5 ml |
- Kultur HBEC-5i in einem belüfteten 25cm 2-Kolben mit 10ml DMEM Vollmedium in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2.
- Passage-Zellen, wenn sie konfluent geworden. Entfernen Sie das alte Medium abgesaugt und waschen zweimal mit DMEM unvollständige mittel-oder Gewebekulturen grade PBS (Ca 2 + und Mg 2 + frei) bis 37 vorgewärmten ° C.
- Add 1 ml vorgewärmten VersuchenPSIN-EDTA (0,025% Trypsin, 0,5 mM EDTA), schwenken, um die Gesamtheit der Kolben abdecken und inkubieren ~ 2 min bei 37 ° C.
- Überprüfen Sie unter inversen Mikroskop, dass mindestens 90% der Zellen wurden abgelöst. Wenn nötig, vorsichtig klopfen den Boden des Kolbens auf adhärente Zellen zu entfernen. Fügen Sie 10 ml DMEM Vollmedium, um das Trypsin und Transfer Zellen in eine 15 ml konische Röhrchen zu blockieren. Zentrifuge für 4 min bei 300 g bei Raumtemperatur (RT).
- Überstand verwerfen und das Pellet mit 10 ml DMEM Vollmedium. Pipette die Lösung nach oben und unten gründlich resuspendieren.
- Fügen Sie 1 oder 2 ml der Zellsuspension in eine neue Kultur einwiegen und 8ml frischem Medium, um die Kultur aufrecht zu erhalten. Bewerten Kultur Wachstum jeden Tag unter einem inversen Mikroskop und ändern Medium alle 2 oder 3 Tage, bevor es gelb wird.
2. Vorbereitung Endothelzellen für eine Auswahl
- Zwei Tage vor dem Tag der selectio n, fügen Fibronektin in sterile PBS (2 g / cm 2) in einem (oder mehreren) 60 mm Petrischale verdünnt. Inkubieren Sie die Schale für 5 bis 20 min bei 37 ° C, dann entfernen Sie die Fibronektin-Lösung, die bei 4 ° C für einen Monat gespeichert werden und wieder einmal verwendet.
- Passage-Zellen wie in den Abschnitten 1.3 beschrieben. bis 1,5. Unter der Annahme, 100% konfluenten Zellen getrennt wurden und erneut in 10ml DMEM Vollmedium (Abschnitt 1.6., Mit einem äquivalenten Volumen Medium resuspendieren, wenn der Konfluenz niedriger ist, z. B. mit 8ml resuspendieren, wenn der Konfluenz betrug 80%), fügen Sie 1,5 ml der suspendierten Zellen, die Fibronektin beschichtete Petrischale und anderen 1,5 ml DMEM Vollmedium.
- Legen Sie die Samen Petrischale in den Brutschrank. Hinweis: Im Idealfall sollte die Konfluenz werden rund 90% zum Zeitpunkt der Auswahl zwei Tage später.
- Optional. So aktivieren Sie HBEC-5i, fügen Sie die TNF (Tumor Nekrose Faktor) Zytokin in einer Endkonzentration von 50μg/ml 24 Stunden vor der Wahl.
- Bereiten Sie die notwendigen Reagenzien (siehe Tabelle hier unter). Bereiten menschlichen roten Blutzellen (RBC) durch die Trennung von Vollblut (Gruppe O +) beim Durchgang durch ein Leukozytendepletionsfilter (siehe "Methoden in Malaria Research" Publikation 11 für allgemeine Malaria-Parasiten Kultivierung). Wash RBC zweimal durch Zentrifugieren bei 400 g für 5 min und Resuspendieren sie mit 10 ml RPMI unvollständig. Keep gewaschen RBC bei 4 ° C zu einer unvollständigen Medium bei 50% Hämatokrit.
| Medium zur Vorbereitung | Reagenzien | Menge |
| "RPMI unvollständig" | RPMI 1640 (mit Bicarbonat) | 500ml |
| Hepes 1M | 12.5ml | |
| Glucose 20% | 5ml | |
| L-Glutamin 200 mM | 5ml | |
| Gentamycin 50mg/ml | 250μl | |
| NaOH 1M | 0,7 ml (pH-Wert auf 7,2) | |
| "RPMI komplett" | "RPMI unvollständig" | 450ml |
| Pooled Menschen (nicht-immunen) Serum | 50ml |
- Kultur P. falciparum infiziert RBC mit RPMI Vollmedium mit 2% Hämatokrit und bei 37 ° C mit 3% CO 2, 1% O 2, und 96% N 2. Machen Giemsa Abstrich 11 tägliche auf die Stufe der Entwicklung des Parasiten (Abbildung 2) zu beurteilen.
- Regelmäßig (ca. einmal pro Woche) zu synchronisieren Kultur durch Sorbit Behandlung 12. Am Tag vor der Wahl Assay Ziel für einen Ring-Bühne Kultur bei 5% Parasitämie oder mehr (im Idealfall mindestens 10%).
4. Auswahl von P. falciparum für cytoadhesion an Endothelzellen
- Am Tag des Tests sollte der Parasit Kultur pigmentierte Trophozoiten Stufe (Abbildung 2) (im Idealfall 10% Parasitämie), während HBEC-5i Kultur sollte bei 50 bis 100% Konfluenz (im Idealfall 90%). 30μl Hämatokrits von Parasiten Kultur pro HBEC-5i Petrischale benötigt.
- Wash Parasiten zweimal durch Zentrifugieren (500 g für 5 min) 1,5 ml der Parasit Kultur. Überstand und resuspendieren mit 10 ml frisch zubereitet, erwärmt, DMEM unvollständige Medium. Wiederholen Sie die Wäsche ein zweites Mal. Resuspendieren 30μl Hämatokrits mit 1,5 ml DMEM unvollständig mit 1% BSA.
- Waschen Sie die HBEC-5i beschichtete Petrischale zweimal Absaugen Medium und das Hinzufügen von 3 ml DMEM unvollständig.
- Fügen Sie die Lösung von Parasiten, die HBEC-5i Gericht und bei 37 ° C für 75min. Resuspendieren Parasiten zweimal (nach 30 und 60 min) während der Inkubationdurch vorsichtiges Schwenken der Schale in die vier Richtungen, sowie im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn.
- Nach der Inkubation der Schale 5-mal durch Absaugen Medium, mit einem Kunststoff-Pasteurpipette bis 3 ml warmem DMEM unvollständige mittlere und sanfte Schaukeln hinzuzufügen. Wenn viele Gerichte benutzt werden, halten sie an einem warmen Oberfläche, wie eine große Flasche mit Wasser bei 37 ° C gefüllt
- Überprüfen Sie die Teller unter einem inversen Mikroskop. Wenn viele infizierte RBC noch sichtbar sind, nicht mehr wäscht, wie oben beschrieben. Handle der Petrischale sehr sorgfältig, um das Risiko einer Kontamination zu vermeiden.
- Entfernen Sie Medium aus der Schüssel und fügen 3ml warmes RPMI Vollmedium mit 40 ul Hämatokrits von frischen uRBC.
- Die Schale in einer luftdichten Kammer inkubiert, Gas für 3 min und Ort der Kammer in einem Brutschrank bei 37 ° C über Nacht.
- Am Tag danach Ernte der Parasiten durch Waschen mit RPMI unvollständige Medium, in ähnlicher Weise wie in Abschnitt 4.4 beschrieben. aber stärker. Keep alle verwendeten Medium (mit resuspendiert RBC) in einer 15 ml konische Röhrchen. Überprüfen Sie unter inversen Mikroskop, dass alle RBC aus der Schale entfernt worden sind.
- Pellet der Parasiten, den Überstand verwerfen, in 5ml RPMI Vollmedium und legen Sie die Mischung in einer Flasche für die normale Züchtung resuspendieren.
5. Repräsentative Ergebnisse
Nicht ausgewählte Parasiten zeigen eine geringe Bindung an HBEC-5i (Abbildung 3A). So wird nach der ersten Runde der Auswahl wird nur sehr wenige Parasiten geerntet und es kann bis zu einem Monat der Kultivierung einer Parasitämie ausreichend für die zweite Auswahlrunde erreichen. Nach jeder Runde der Selektion, binden mehr und mehr Parasiten auf die Endothelzellen und die Auswahl kann in kürzeren Zeitabständen wiederholt werden. Nach 4-5 Runden der Selektion, sind High-Bindung Parasitenpopulation erhalten (Abbildung 3).
In unseren Händen, wurde die Bindung von HB3-HBEC zu HBEC-5i oder TNF aktiviert HBEC-5i von simIlar Ebene (Daten nicht gezeigt).
Die hier beschriebene Protokoll wurde mit 4 P. getestet falciparum-Stämme: HB3, IT/FCR3, 3D7 und Dd2 (Tabelle 1). Nur die letztere erwies sich nicht in der Lage zu HBEC-5i zu binden, auch nach 5 Runden der Selektion.
HB3 Parasiten wurden auch für cytoadherence Human Dermal und pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMEC und HPMEC) ausgewählt. Nach 4 Runden der Selektion, mit der hier beschriebenen Methode wurde eine High-Bindung der Bevölkerung auf beiden HDMEC und HPMEC (Abbildung 4).
Abbildung 1. Überblick über den Auswahlprozess.
Abbildung 2. Entwicklungsstadien von P. falciparum infiziert rote Blutkörperchen. Giemsa-Abstrich unter dem Mikroskop sichtbar zu 1000x Vergrößerung.
Abbildung 3. Typisches Beispiel von Parasiten Bindung an HBEC-5i. (A) Die blaue Schicht ist HBEC-5i fixiert mit Glutaraldehyd und mit Giemsa, visualisiert unter dem Mikroskop bei 1000facher Vergrößerung. Die Bilder wurden aufgenommen, nachdem uRBC und ungebundenen iRBC weggespült wurden. Die linke Tafel zeigt ein einzelnes P. falciparum HB3 (nicht ausgewählt) Parasit HBEC-5i gebunden. Im rechten Bereich der HB3-HBEC Parasiten hatten für 5 Runden ausgewählt worden. (B) Daten stellt den Mittelwert aus zwei unabhängigen Experimenten, die jeweils doppelt durchgeführt. Die Zahl der Parasiten pro Endothelzellen gebunden wurde gezählt.
Tabelle 1. Zusammenfassung von Plasmodium falciparum-Stämme, die erfolgreich für die Bindung an HBEC-5i. Beachten Sie, dass HB3 auch auf TNF-aktivierten HB ausgewählt wurden ausgewähltEC-5i. Nach 5 Runden der Selektion zeigten die Dd2 Belastung keine Zunahme der Bindung an HBEC-5i im Vergleich zu unselektierten-Dd2.
Abbildung 4. Bindung von P. falciparum HB3 Parasiten dermal (HDMEC) und Lungenembolien (HPMEC) Endothelzellen, vor und nach 4 Runden der Selektion. Obwohl der Nährboden für HDMEC und HPMEC leicht unterscheidet (siehe Anweisungen des Herstellers), wurde das Protokoll für die Auswahl identisch mit HBEC-5i. Pictures at 400-facher Vergrößerung aufgenommen.
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| DMEM-F12 Ham | Sigma | D6421 | Für DMEM Vollmedium |
| L-Glutamin 200 mM | GIBCO | 25030 | Für DMEM und RPMI Vollmedium |
| Penicillin / Streptomycin 100X (10000 units / ml und 10mg/ml) | ScienCell | 0503 | Für DMEM Vollmedium |
| Fetale Bovine Serum hitzeinaktiviertem | ScienCell | 0025 | Für DMEM Vollmedium |
| Trypsin-EDTA (0,025% Trypsin, 0,5 mM EDTA) | ScienCell | 0103 | |
| Endothelzellwachstum ergänzen | ScienCell | 1052 | Für DMEM Vollmedium |
| Gewebekultur behandelt 60 mm X 15 mm Petrischalen | BD | 353002 | |
| Humanem Fibronectin | Millipore | FC010 | Verwenden Sie bei 2 g / cm 2 |
| TNF | R &D Systems | 210-TA | optional, bei 50 pg / ml Einsatz |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167f | Für RPMI Vollmedium |
| Gentamycin 50mg/ml | Lonza | 17-518Z | Für RPMI Vollmedium |
| Hepes 1M | Lonza | BE17-737E | Für RPMI Vollmedium |
| HDMEC | ScienCell | 2000 | Primary-Zelllinie |
| HPMEC | ScienCell | 3000 | Primary-Zelllinie |
| HBEC-5i | Gewonnen aus Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) |
Tabelle 2. Materials
Discussion
Das Markenzeichen von zerebraler Malaria ist die Beschlagnahme von P. falciparum iRBC innerhalb des Gehirns Mikrovaskulatur 2, 3. Doch in vitro-Kulturen von P. falciparum nur schlecht cytoadhere zu HBEC-5i, ein Modell für menschliche Gehirn mikrovaskulären Endothel. Hier entwickelten wir eine einfache Assay einer Bevölkerung für die Bindung an HBEC-5i, eine "in-vivo wie" Phänotyp zu bereichern. Drei von 4 P. falciparum-Stämme wurden erfolgreich gewählt mit dieser Methode. Darüber hinaus wurde HB3 auch auf HDMEC und HPMEC ausgewählt, was darauf hinweist, dass dieses Protokoll für verschiedene Parasiten und endothelialen Zelltypen verwendet werden kann.
Verschiedene Hypothesen können erklären die mangelnde Bindung mit dem Dd2 Belastung. Die wahrscheinlichste ist die Tatsache, dass dieser Parasit line knobless ist, die tief behindert die cytoadherence 13, 14.
Wir empfehlen Kultivierung unselected Parasiten neben der Auswahl proZugang zu einem Steuerelement zum Vergleich bieten. Dies ermöglicht zum Beispiel den Vergleich der Transkriptom von verbindlichen und unverbindlichen Parasiten, mit der Hoffnung, Parasiten Ligand Kandidaten.
TNF ist ein Zytokin, auf hohem Niveau in der zerebralen Malaria-Patienten gefunden und wurde zu zeigen, die Expression vieler Oberflächenproteine HBEC-5i (Claessens et al, in Vorbereitung und 8, 15, 16) zu induzieren. In diesem Fall war die Menge an gebundenem iRBC ähnlich im normalen HBEC-5i im Vergleich zu aktivierten HBEC-5i.
Diese "Sequestrierung Modell" kann auch verwendet werden, um die molekulare Wechselwirkung zwischen den iRBC und Endothelzellen, sowie die Wirkung der vermeintlichen Anti-cytoadherence Drogen zu untersuchen. In diesem Fall empfehlen wir plating HBEC-5i in kleineren Brunnen, wie "8-Well-Kammer-Objektträgern" (BD 354628) oder "CultureWell" (Sigma C7735-20EA).
Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Francisco Candal, CDC Technology Transfer Office, Atlanta Georgia für HBEC-5i-Zellen. Diese Arbeit wurde von den Wellcome Trust (4 Jahre Doktorandenstelle an AC-und Senior Fellowship in Basic Biomedical Science to JAR, Grant-Nummer 084226) gefördert.
References
- Scherf, A. Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum. Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).
- MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration. Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).
- Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children. J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).
- Taylor, T. E. Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts. Nat. Med. 10, 143-145 (2004).
- van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction. Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).
- Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain. Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).
- Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications. Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).
- Xiao, L. Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells. Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).
- Corrigan, R. A., Rowe, J. A. Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum. Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).
- Rowe, J. A. Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication. Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).
- Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. (2009).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).
- Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. Cell. Microbiol. , (2009).
- Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface. J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).
- Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria. Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).
- Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum. Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).
