Summary
Un
Abstract
La maggior parte delle morti per malaria umana è causata dal sangue allo stadio parassiti Plasmodium falciparum. Malaria cerebrale, la complicanza più pericolosa per la vita della malattia, è caratterizzata da un accumulo di Plasmodium falciparum cellule infettate globuli rossi (iRBC) nella prima fase vegetativa pigmentate nel microcircolo del cervello 2-4. Questa ostruzione microvascolare (sequestro) porta ad acidosi, ipossia e nocivi citochine infiammatorie (recensione a 5). Sequestro si trova anche nella maggior parte dei tessuti microvascolari del corpo umano, 2, 3. Il meccanismo con cui iRBC attaccare alle pareti dei vasi sanguigni è ancora poco compresa.
Il immortalato umane endoteliali microvascolari cerebrali linea cellulare (HBEC-5i) è stato usato come un modello in vitro di barriera emato-encefalica 6. Tuttavia, Plasmodium falciparum iRBC allegare solo male a HBEC-5i in vitro, a differenza del sequestrat densoione che si verifica in casi di malaria cerebrale. Abbiamo quindi sviluppato un test per selezionare panning (arricchire) varie P. ceppi di P. falciparum per l'adesione al HBEC-5i al fine di ottenere popolazioni di alta vincolante parassiti, più rappresentativo di ciò che accade in vivo.
Un campione di una cultura parassita (miscela di iRBC e non infetti RBC) in fase di trofozoite pigmentata viene lavata e incubata su uno strato di HBEC-5i coltivate su una piastra di Petri. Dopo l'incubazione, il piatto viene delicatamente lavato e privo di uRBC iRBC legato. Fresco uRBC vengono aggiunti al iRBC pochi allegata al HBEC-5i e incubato per una notte. Come parassiti fase schizonte scoppio, merozoiti inscatoli reinvade RBC e questi parassiti anello fase vengono raccolte il giorno successivo. I parassiti sono coltivati fino abbastanza materiale si ottiene (in genere 2 a 4 settimane) e un nuovo round di selezione può essere eseguita. A seconda del P. falciparum ceppo, da 4 a 7 giri di selezione sono necessari al fine di ottenere una popolazionedove la maggior parte dei parassiti si legano ai HBEC-5i. Il fenotipo legame è progressivamente perso dopo poche settimane, che indica un interruttore di espressione del gene variante antigene di superficie, quindi la selezione regolari HBEC-5i è necessario per mantenere il fenotipo.
In sintesi, abbiamo sviluppato un test di rendering selezione P. falciparum parassiti più "cerebrale adesivo malaria" fenotipo. Siamo stati in grado di selezionare 3 su 4 P. ceppi di P. falciparum in HBEC-5i. Questo test è stato utilizzato con successo anche per selezionare i parassiti per il legame di cellule umane endoteliali cutanea e polmonare. È importante sottolineare che questo metodo può essere usato per selezionare tessuto-specifiche popolazioni di parassiti al fine di individuare ligandi parassita candidato per il legame di endotelio cerebrale. Inoltre, questo test può essere usato per individuare presunti anti-sequestro di droga 7.
Protocol
Raccomandazioni generali
Umano microvascolari cerebrali delle cellule endoteliali (HBEC-5i) la cultura è stato precedentemente descritto in 6, 8. P. parassiti falciparum sono stati coltivati come in 9. Entrambi HBEC-5i e P. falciparum culture parassita deve essere conservato in condizioni sterili in ogni momento. Tutti i reagenti devono essere pre-riscaldato a 37 ° C. Si consiglia di controllare regolarmente la contaminazione da micoplasma 10 mediante PCR (Minevera Biolabs, le istruzioni del produttore successivo). Il protocollo è riassunto nella Figura 1.
1. Cellule endoteliali cultura di routine
- Preparare i reagenti necessari.
| Medio per preparare | Reagenti | Quantità |
| "Incompleto DMEM" | DMEM-F12 Ham | 500ml |
| | L-glutammina 200mm | 5ml |
| Penicillina / streptomicina 100X | 5 ml | |
| NaOH 1M | 1,3 ml (aggiustare il pH a 7,4) | |
| "Completo DMEM" | "Incompleto DMEM" | 450ml |
| Siero fetale bovino inattivato al calore | 50ml | |
| Supplemento di crescita delle cellule endoteliali | 5 ml |
- Cultura HBEC-5i in una reflex 25 centimetri 2 pallone con media 10ml DMEM completo in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Celle di passaggio quando diventano confluenti. Rimuovere il supporto di vecchia aspirazione e lavare due volte con medium DMEM incompleti o tessuto della cultura di grado PBS (Ca 2 + e Mg 2 + libero) pre-riscaldato a 37 ° C.
- Aggiungere 1 ml di pre-riscaldato Provapsin-EDTA (0,025% tripsina, 0.5MM EDTA), agitare per coprire la totalità del pallone e incubare per circa 2 min a 37 ° C.
- Controllare al microscopio invertito che almeno il 90% delle cellule sono stati staccati. In caso di necessità, bussare delicatamente la parte inferiore del pallone per staccare le cellule aderenti. Aggiungere 10 ml di medium DMEM completo di bloccare le cellule tripsina e trasferire in una provetta da 15 ml conica. Centrifugare per 4 min a 300 gr a temperatura ambiente (RT).
- Eliminare il surnatante e risospendere il pellet con 10 ml di medium DMEM completo. Pipettare la soluzione su e giù per risospendere completamente le cellule.
- Aggiungere 1 o 2 ml di sospensione cellulare in un pallone nuova cultura e aggiungere 8 ml di terreno fresco per mantenere la cultura. Valutare la crescita della cultura ogni giorno sotto un microscopio rovesciato e il cambiamento di media ogni 2 o 3 giorni prima che diventa gialla.
2. Preparazione cellule endoteliali per una selezione
- Due giorni prima del giorno del Selectio n, aggiungere fibronectina diluito in PBS sterile (2 mg / cm 2) in uno (o più) 60 millimetri piatto di Petri. Incubare il piatto per 5 a 20 min a 37 ° C, quindi rimuovere la soluzione di fibronectina, che possono essere conservati a 4 ° C per un mese e riutilizzati una volta.
- Celle di passaggio, come descritto nei paragrafi 1.3. a 1,5. Assumendo che le cellule del 100% confluenti sono state staccate e risospesi in media 10ml DMEM completo (sezione 1.6., Risospendere con un volume equivalente di media se la confluenza è inferiore, ad esempio, risospendere con 8ml se la confluenza è stata 80%), aggiungere 1,5 ml di sospensione cellule alla fibronectina piatto rivestito di Petri e un altro 1,5 ml di medium DMEM completo.
- Porre la capsula Petri seminati in incubatrice. Nota: Idealmente, la confluenza sarà di circa il 90% al momento della selezione di due giorni dopo.
- Opzionale. Per attivare HBEC-5i, aggiungere la (fattore di necrosi tumorale) citochina TNF ad una concentrazione finale di 50μg/ml 24 ore precedenti la selezione.
- Preparare i reagenti necessari (vedi tabella qui sotto). Preparare umano globuli rossi (RBC) separando sangue intero (gruppo O +) dal passaggio attraverso un filtro a esaurimento dei leucociti (vedere "Metodi di Ricerca in Malaria" pubblicazione 11 per la coltura generale parassiti della malaria). Lavare RBC due volte per centrifugazione a 400 g per 5 min e risospendere con 10 ml RPMI incompleta. Tenere RBC lavati a 4 ° C in media incompleta al 50% di ematocrito.
| Medio per preparare | Reagenti | Quantità |
| "Incompleto RPMI" | RPMI 1640 (con il bicarbonato) | 500ml |
| Hepes 1M | 12.5ml | |
| Glucosio 20% | 5ml | |
| L-glutammina 200mm | 5ml | |
| Gentamicina 50mg/ml | 250μl | |
| NaOH 1M | 0,7 ml (aggiustare il pH a 7,2) | |
| "RPMI completo" | "Incompleto RPMI" | 450ml |
| Pool umano (non immune) nel siero | 50ml |
- Cultura P. falciparum dei globuli rossi infetti con il mezzo RPMI completo al 2% di ematocrito ed incubare a 37 ° C con il 3% di CO 2, 1% O 2, e 96% N 2. Fai striscio Giemsa 11 al giorno per valutare lo stadio di sviluppo di parassiti (Figura 2).
- Regolarmente (circa una volta alla settimana), sincronizzare la cultura da un trattamento sorbitolo 12. Il giorno prima il test di selezione, allo scopo di un anello allo stadio cultura parassitemia al 5% o più (idealmente almeno 10%).
4. Selezione di P. falciparum per cytoadhesion alle cellule endoteliali
- Il giorno del test, la cultura parassita dovrebbe essere in fase vegetativa pigmentate (Figura 2) (idealmente parassitemia 10%), mentre HBEC-5i cultura dovrebbe essere da 50 a 100% confluenza (idealmente 90%). 30μl di ematocrito di cultura parassita è necessaria per HBEC-5i piastra di Petri.
- Lavare i parassiti due volte per centrifugazione (500 g per 5 min) 1,5 ml di cultura parassita. Gettare il surnatante e risospendere con 10 ml di appena fatto, riscaldato, medio DMEM incompleta. Ripetere il lavaggio una seconda volta. Risospendere il volume di 30μl di ematocrito, con 1,5 ml di incompleto con 1% di BSA DMEM.
- Lavare i HBEC-5i piatto rivestito di Petri due volte aspirante medio e aggiungendo 3 ml di DMEM incompleta.
- Aggiungere la soluzione di parassiti al HBEC-5i piatto e incubare a 37 ° C per 75 min. Risospendere parassiti due volte (dopo 30 e 60 minuti) durante l'incubazionedelicatamente a dondolo il piatto nelle quattro direzioni, così come in senso orario e antiorario.
- Dopo l'incubazione, lavare il piatto 5 volte aspirando mezzo, utilizzando una pipetta Pasteur di plastica per aggiungere 3 ml di medium caldo DMEM incompleti, rock e leggera. Se molti piatti vengono utilizzati, tenerli su di una superficie calda, come un gran fiasco pieno d'acqua a 37 ° C.
- Controllare il piatto sotto un microscopio invertito. Se molti dei globuli rossi infetti sono ancora visibili, fare di più lavaggi come descritto sopra. Maneggiare la piastra Petri con molta attenzione per evitare qualsiasi rischio di contaminazione.
- Rimuovere media dal piatto e aggiungere 3 ml di medium caldo RPMI completo con 40μl di ematocrito di uRBC fresca.
- Porre la capsula in una camera stagna in incubazione, il gas per 3 minuti e il luogo della camera in un incubatore a 37 ° C durante la notte.
- Il giorno dopo, raccogliere i parassiti dal lavaggio con media RPMI incompleta, in modo simile a quanto descritto nel paragrafo 4.4. ma più vigorosamente. Keep tutti mezzo utilizzato (contenente risospeso RBC) in un tubo 15ml conica. Controllare al microscopio invertito che tutte le RBC sono state rimosse dal piatto.
- Pellet i parassiti, scartare il surnatante, risospendere in 5ml media RPMI completo e inserire il composto in un recipiente per la coltura normale.
5. Rappresentante Risultati
Parassiti non selezionati mostrano un basso livello di legame HBEC-5i (Figura 3A). Così, dopo il primo turno di selezione, parassiti molto pochi saranno raccolti e può richiedere fino a un mese di coltura per raggiungere una parassitemia sufficiente per il secondo round di selezione. Dopo ogni turno di selezione, parassiti sempre più si legano alle cellule endoteliali e le selezioni possono essere ripetuti ad intervalli di tempo più brevi. Dopo 4-5 giri di selezione, ad alta vincolante popolazioni parassita sono ottenuti (Figura 3).
Nelle nostre mani, il legame di HB3-HBEC a HBEC-5i o TNF attivato HBEC-5i era di simmili livello (dati non riportati).
Il protocollo qui descritto è stato testato con 4 P. ceppi di P. falciparum: HB3, IT/FCR3, 3D7 e DD2 (Tabella 1). Solo quest'ultimo non si è dimostrato in grado di legarsi a HBEC-5i, anche dopo 5 turni di selezione.
HB3 parassiti sono stati anche selezionati per cytoadherence di cellule microvascolari cutanea e polmonare endoteliale (HDMEC e HPMEC). Dopo 4 turni di selezione, secondo il metodo descritto qui, un alto legame popolazione sono stati ottenuti su entrambi i HDMEC e HPMEC (Figura 4).
Figura 1. Panoramica del processo di selezione.
Figura 2. Stadi di sviluppo di P. falciparum globuli rossi infetti. Striscio Giemsa visualizzati al microscopio con ingrandimento 1000X.
Figura 3. Tipico esempio di parassiti legame HBEC-5i. (A) Lo strato blu è HBEC-5i fissati con glutaraldeide e colorati con Giemsa, visualizzati al microscopio con ingrandimento 1000X. Le foto sono state scattate dopo uRBC e iRBC non legato sono state spazzate via. Il pannello a sinistra mostra un unico P. falciparum HB3 (non selezionato) parassita legato a HBEC-5i. Nel pannello di destra la HB3-HBEC parassiti erano stati selezionati per 5 round. (B) I dati rappresentano la media di due esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito in duplice copia. Il numero di parassiti legati per cellule endoteliali è stato contato.
Tabella 1. Sintesi dei ceppi di Plasmodium falciparum, che si sono selezionati per il legame a HBEC-5i. HB3 Si noti che è stato anche selezionato per il TNF-attivato HBCE-5i. Dopo 5 turni di selezione, il ceppo DD2 non ha mostrato alcun aumento del legame con HBEC-5i rispetto ai non selezionati-DD2.
Figura 4. Legame di P. falciparum HB3 parassiti cutanea (HDMEC) e polmonare (HPMEC), le cellule endoteliali, prima e dopo 4 turni di selezione. Anche se il terreno di coltura per HDMEC e HPMEC differisce leggermente (vedi istruzioni del fornitore), il protocollo utilizzato per la selezione era identico come HBEC-5i. Foto scattate con ingrandimento 400X.
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| DMEM-F12 Ham | Sigma | D6421 | Per le medie DMEM completo |
| L-glutammina 200mm | GIBCO | 25030 | Per le medie e DMEM RPMI completo |
| Penicillina / streptomicina 100X (10000 unità / ml e 10 mg) | ScienCell | 0503 | Per le medie DMEM completo |
| Siero fetale bovino inattivato al calore | ScienCell | 0025 | Per le medie DMEM completo |
| Tripsina-EDTA (0,025% tripsina, 0.5mm EDTA) | ScienCell | 0103 | |
| Supplemento di crescita delle cellule endoteliali | ScienCell | 1052 | Per le medie DMEM completo |
| Cultura tessuto trattato 60 mm x 15 millimetri Petri | BD | 353002 | |
| Fibronectina umana | Millipore | FC010 | Utilizzare a 2 mg / cm 2 |
| TNF | R &D Systems | 210-TA | opzionale, l'uso a 50 mcg / ml |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | Per le medie RPMI completo |
| Gentamicina 50mg/ml | Lonza | 17-518Z | Per le medie RPMI completo |
| Hepes 1M | Lonza | Be17-737E | Per le medie RPMI completo |
| HDMEC | ScienCell | 2000 | Linea di cellule primarie |
| HPMEC | ScienCell | 3000 | Linea di cellule primarie |
| HBEC-5i | Ottenuto da Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) |
Tabella 2. Materiali
Discussion
Il segno distintivo della malaria cerebrale è il sequestro di P. falciparum iRBC all'interno del cervello microcircolo 2, 3. Tuttavia, in colture in vitro di P. falciparum solo poco cytoadhere a HBEC-5i, un modello per endotelio microvascolare del cervello umano. Qui abbiamo messo a punto un test semplice per arricchire una popolazione per il legame a HBEC-5i, una più "in vivo come" fenotipo. Tre su 4 P. ceppi di P. falciparum sono stati scelti con successo utilizzando questo metodo. Inoltre, HB3 è stato anche selezionato HDMEC e HPMEC, indicando che questo protocollo può essere utilizzato per vari tipi di parassita delle cellule endoteliali.
Diverse ipotesi può spiegare la mancanza di legame con il ceppo DD2. La più probabile è il fatto che questa linea parassita è knobless, che ostacola fortemente il cytoadherence 13, 14.
Si consiglia di parassiti coltura selezionata insieme al pro selezionecesso per fornire un controllo per il confronto. Ciò consentirà, ad esempio, confrontando il trascrittoma di parassiti vincolanti e non vincolanti, con la speranza di scoprire i candidati ligando parassita.
TNF è una citochina trova ad alto livello in pazienti affetti da malaria cerebrale ed è stato spettacolo di indurre l'espressione delle proteine di superficie molte delle HBEC-5i (Claessens et al, in preparazione e 8, 15, 16). In questo caso, la quantità di iRBC legato era simile nei normali HBEC-5i rispetto al attivato HBEC-5i.
Questo "modello di sequestro" può essere usato anche per studiare le interazioni molecolari tra il iRBC e le cellule endoteliali, così come l'effetto del presunto anti-cytoadherence farmaci. In questo caso, si consiglia di placcatura HBEC-5i in piccoli pozzi, come ad esempio "8-bene diapositive da camera" (BD 354628) o "CultureWell" (Sigma C7735-20EA).
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Francesco Candal, CDC Technology Transfer Office, Atlanta Georgia per HBEC-5i cellule. Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust (4 volte all'anno borsa di studio di dottorato di AC e Senior Fellowship in Basic Scienze Biomediche alle JAR, concedere numero 084226).
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