Cet article décrit l'étiquetage de surface et<em> Ovo ex</emCulture de tissus> dans l'embryon de poulet au début. Techniques prêtent à time-lapse en champ clair, fluorescence et tomographie par cohérence optique d'imagerie sont présentés. Étiquettes de surface suivi de la résolution spatio-temporelle élevée permet des quantités cinématiques telles que les souches morphogénétiques (déformations) doit être calculé à la fois dans deux et trois dimensions.
Embryonic épithélium subir des déformations complexes (par exemple flexion, de torsion, le pliage et étirement) pour former les organes primitifs de l'embryon précoce. Suivi des marqueurs fiduciaires sur les surfaces de ces feuilles cellulaire est une méthode bien établie pour l'estimation des quantités morphogénétiques tels que la croissance, la contraction et de cisaillement. Cependant, toutes les techniques de marquage de surface sont facilement adaptables aux modalités d'imagerie conventionnelles et possèdent différents avantages et ses limites. Ici, nous décrivons deux méthodes de marquage et d'illustrer l'utilité de chaque technique. Dans la première méthode, des centaines de marqueurs fluorescents sont appliquées simultanément à l'embryon en utilisant des particules de fer magnétique. Ces étiquettes sont ensuite utilisés pour la quantité déformations des tissus en 2-D lors de la morphogenèse. Dans la seconde méthode, microsphères de polystyrène sont utilisés comme agents de contraste chez les non-invasive tomographie par cohérence optique (OCT) d'imagerie pour suivre les déformations des tissus en 3-D. Ces techniques ont été couronnés de succèsment mis en œuvre dans notre laboratoire pour studythe mécanismes physiques de la tête fois au début, le cœur et le développement du cerveau, et devrait être adaptable à une large processus morphogénétiques gamme.
Deux techniques de marquage des tissus sont présentés pour la culture ex ovo d'embryons de poulet au début. La première utilise les colorants lipophiles fluorescents livrés par des particules de fer magnétique à la fois l'étiquette des centaines de cellules. Cependant, cette méthode n'est actuellement pas compatible avec la tomographie par cohérence optique, comme des colorants fluorescents montrent généralement peu de contraste dans les tissus environnants en utilisant le 10 octobr…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R01 et R01 GM075200 HL083393 (LAT). Nous reconnaissons le soutien de bourses pour les FBA du NIH et le T90 DA022871 Mallinckrodt Institute of Radiology, et pour VDV d'octroi 09PRE2060795 de la American Heart Association.
Material / Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
Whatman #2 Filter Paper | Whatman | 1002 090 | 90mm diameter |
Glass Micropipettes | World Precision Instruments (WPI) | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
DiI | Invitrogen | D-282 | |
Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences Inc. | 24294 | |
Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |