Summary

מעקב אחר דפורמציות המוךפו"גנטי שהולך רקמות בעובר צ'יק מוקדם

Published: October 17, 2011
doi:

Summary

מאמר זה מתאר תיוג פני השטח<em> אובו לשעבר</em> תרבות רקמות בעובר האפרוח מוקדם. טכניקות מקובל בתחום זמן לשגות בהיר, פלואורסצנציה, אופטיות הדמיה טומוגרפיה קוהרנטיות מוצגים. תוויות משטח מעקב עם רזולוציה גבוהה המאפשרת spatiotemporal כמויות kinematic כגון זני המוךפו"גנטי שהולך (דפורמציות) להיות מחושב גם שניים או שלושה ממדים.

Abstract

עובריים epithelia לעבור דפורמציות מורכבים (למשל, כפיפה, פיתול, קיפול, מתיחה) לטופס איברים פרימיטיביים של העובר מוקדם. מעקב אחר סמנים fiducial על פני השטח של אלה גיליונות הסלולר היא שיטה מבוססת היטב להערכת כמויות המוךפו"גנטי שהולך כגון, צמיחה גזירה התכווצות,. עם זאת, לא כל תיוג טכניקות פני השטח הם להתאמה בקלות שיטות הדמיה קונבנציונאלי בעל יתרונות ומגבלות שונות. כאן, אנו מתארים שתי שיטות תיוג להמחיש את התועלת של כל טכניקה. בשיטה הראשונה, מאות תוויות ניאון מוחלים בעת ובעונה אחת לעובר באמצעות חלקיקי ברזל מגנטיים. תוויות אלה משמשים לאחר מכן כמות 2-D דפורמציות רקמות במהלך המורפוגנזה. בשיטה השנייה, פוליסטירן microspheres משמשים סוכנים בניגוד ב פולשני הדמיה טומוגרפיה אופטית (אוקטובר) כדי לעקוב אחר קוהרנטיות 3-D דפורמציות רקמות. טכניקות אלו הצליחוly מיושם במעבדה שלנו studythe המנגנונים הפיזיים של קיפול הראש בלב מוקדם, והתפתחות המוח, ויש להתאמה לתהליכים המוךפו"גנטי שהולך רחב טווח.

Protocol

1. הכנה ניסויית כללי הכן תרבות בינוני רקמות למכסה המנוע לזרום למינרית. מדולל בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) (1 בקבוק עם 4.5g L / L גלוקוז, סודיום ביקרבונט, ו-L-גלוטמין). הוסף 10 מ&q…

Discussion

שני תיוג טכניקות רקמה מוצגים לתרבות אובו לשעבר של עוברים חומוס מוקדם. הראשונה משתמשת בצבעי ניאון lipophilic שיישלח באמצעות חלקיקי ברזל מגנטי בו זמנית תווית מאות תאים. עם זאת, שיטה זו היא כיום אינו תואם טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית, כמו צבעי ניאון בדרך כלל להראות בניגוד…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים GM075200 R01 ו R01 HL083393 (LAT). אנו מכירים תמיכה המילגה עבור BAF מ NIH T90 DA022871 ומכון Mallinckrodt לרדיולוגיה, ועל VDV מ 09PRE2060795 מענק מאיגוד הלב האמריקני.

Materials

Material / Reagent Company Catalogue number Comments
DMEM – high glucose Sigma-Aldrich D5796  
Penicillin/Streptomycin/Neomycin Sigma-Aldrich P4083  
Chicken Serum Invitrogen 16110-082  
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D1408 10X
Whatman #2 Filter Paper Whatman 1002 090 90mm diameter
Glass Micropipettes World Precision Instruments (WPI) TW150-6 1.5mm inner diameter
DiI Invitrogen D-282  
Iron Reduced Mallinckrodt Baker Inc. 5320  
10 μm Diameter Microspheres (black) Polysciences Inc. 24294  
Delta T Dish (for time lapse culture) Bioptechs 04200415B 0.17mm thick, black
Delta T4 Culture Dish Controller Bioptechs 0420-4-03  
Mini-Pump Variable Flow Device Fisher Scientific    

References

  1. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
  2. Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
  3. Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces. Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).
  4. Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia. Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).
  5. Kozel, B. A. Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).
  6. Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart. Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).
  7. Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development. Development. 137, 3801-3811 (2010).
  8. Van Essen, D. C. An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex. J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).
  9. Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis. J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).
  10. Yuan, S. Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging. Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).
  11. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).
  12. Blanchard, G. B. Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation. Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).

Play Video

Cite This Article
Filas, B. A., Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo. J. Vis. Exp. (56), e3129, doi:10.3791/3129 (2011).

View Video