Monitoraggio Deformazioni tessuto morfogenetica in embrione di pollo primi
Summary
Questo articolo descrive l'etichettatura di superficie e<em> Ex ovo</em> Coltura tissutale nei primi embrionali di pollo. Tecniche suscettibili di time-lapse in campo chiaro, fluorescenza, e tomografia a coerenza ottica di imaging sono presentati. Etichette superficie inseguimento ad alta risoluzione spazio-temporale consente di grandezze cinematiche quali ceppi morfogenetici (deformazioni) deve essere calcolato in due e tre dimensioni.
Abstract
Embrionale epiteli subiscono deformazioni complesse (ad es flessione, torsione, piegatura, e stretching) per formare gli organi primitiva dell'embrione precoce. Monitoraggio marcatori fiduciali sulla superficie di questi fogli cellulare è una consolidata metodo per stimare quantità morfogenetici, come la crescita, la contrazione e taglio. Tuttavia, non tutte le tecniche di etichettatura di superficie sono facilmente adattabili alle modalità di imaging convenzionali e in possesso di diversi vantaggi e limitazioni. Qui, descriviamo due metodi di etichettatura e illustrare l'utilità di ogni tecnica. Nel primo metodo, centinaia di etichette fluorescenti sono applicate simultaneamente per l'embrione utilizzando particelle di ferro magnetico. Queste etichette vengono poi utilizzati per quantità 2-D deformazioni durante la morfogenesi dei tessuti. Nel secondo metodo, microsfere di polistirolo sono utilizzati come agenti di contrasto a non invasiva tomografia a coerenza ottica (OCT) per tenere traccia di imaging 3-D deformazioni del tessuto. Queste tecniche hanno avuto successoLy implementato nel nostro laboratorio per studioIl meccanismi fisici di piegare la testa all'inizio, il cuore, e lo sviluppo del cervello, e dovrebbe essere adattabile ad una vasta processi morfogenetici gamma.
Protocol
Discussion
Due tecniche di etichettatura dei tessuti vengono presentati per la cultura ex ovo di embrioni di pollo precoce. Il primo utilizza coloranti fluorescenti lipofile forniti tramite particelle di ferro magnetico di etichettare simultaneamente centinaia di cellule. Tuttavia, questo metodo non è attualmente compatibile con tomografia a coerenza ottica, come tinture fluorescenti mostrano generalmente poco contrasto da tessuti circostanti con 10 ott. Quindi, ci mostrano una tecnica alternativa utilizzando …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede GM075200 R01 e R01 HL083393 (LAT). Riconosciamo il supporto borsa di studio per BAF dal NIH T90 DA022871 Mallinckrodt e l'Istituto di Radiologia, e per VDV da concedere 09PRE2060795 dalla American Heart Association.
Materials
| Material / Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments (WPI) | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
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