Summary

Monitoraggio Deformazioni tessuto morfogenetica in embrione di pollo primi

Published: October 17, 2011
doi:

Summary

Questo articolo descrive l'etichettatura di superficie e<em> Ex ovo</em> Coltura tissutale nei primi embrionali di pollo. Tecniche suscettibili di time-lapse in campo chiaro, fluorescenza, e tomografia a coerenza ottica di imaging sono presentati. Etichette superficie inseguimento ad alta risoluzione spazio-temporale consente di grandezze cinematiche quali ceppi morfogenetici (deformazioni) deve essere calcolato in due e tre dimensioni.

Abstract

Embrionale epiteli subiscono deformazioni complesse (ad es flessione, torsione, piegatura, e stretching) per formare gli organi primitiva dell'embrione precoce. Monitoraggio marcatori fiduciali sulla superficie di questi fogli cellulare è una consolidata metodo per stimare quantità morfogenetici, come la crescita, la contrazione e taglio. Tuttavia, non tutte le tecniche di etichettatura di superficie sono facilmente adattabili alle modalità di imaging convenzionali e in possesso di diversi vantaggi e limitazioni. Qui, descriviamo due metodi di etichettatura e illustrare l'utilità di ogni tecnica. Nel primo metodo, centinaia di etichette fluorescenti sono applicate simultaneamente per l'embrione utilizzando particelle di ferro magnetico. Queste etichette vengono poi utilizzati per quantità 2-D deformazioni durante la morfogenesi dei tessuti. Nel secondo metodo, microsfere di polistirolo sono utilizzati come agenti di contrasto a non invasiva tomografia a coerenza ottica (OCT) per tenere traccia di imaging 3-D deformazioni del tessuto. Queste tecniche hanno avuto successoLy implementato nel nostro laboratorio per studioIl meccanismi fisici di piegare la testa all'inizio, il cuore, e lo sviluppo del cervello, e dovrebbe essere adattabile ad una vasta processi morfogenetici gamma.

Protocol

1. Preparazione generale Sperimentale Preparare terreno di coltura dei tessuti in cappa a flusso laminare. Diluire Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) (1 bottiglia di L con 4,5 g / L glucosio, bicarbonato di sodio, e L-glutamina). Aggiungere 10 ml di penicillina / streptomicina / neomicina antibiotici. Togliere 100 ml di DMEM con una pipetta sterile per il trasferimento e sostituire con 100 ml di siero pulcino. Aliquota del pulcino DMEM/10% di siero / 1% di antibiotici sterili in…

Discussion

Due tecniche di etichettatura dei tessuti vengono presentati per la cultura ex ovo di embrioni di pollo precoce. Il primo utilizza coloranti fluorescenti lipofile forniti tramite particelle di ferro magnetico di etichettare simultaneamente centinaia di cellule. Tuttavia, questo metodo non è attualmente compatibile con tomografia a coerenza ottica, come tinture fluorescenti mostrano generalmente poco contrasto da tessuti circostanti con 10 ott. Quindi, ci mostrano una tecnica alternativa utilizzando …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede GM075200 R01 e R01 HL083393 (LAT). Riconosciamo il supporto borsa di studio per BAF dal NIH T90 DA022871 Mallinckrodt e l'Istituto di Radiologia, e per VDV da concedere 09PRE2060795 dalla American Heart Association.

Materials

Material / Reagent Company Catalogue number Comments
DMEM – high glucose Sigma-Aldrich D5796  
Penicillin/Streptomycin/Neomycin Sigma-Aldrich P4083  
Chicken Serum Invitrogen 16110-082  
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D1408 10X
Whatman #2 Filter Paper Whatman 1002 090 90mm diameter
Glass Micropipettes World Precision Instruments (WPI) TW150-6 1.5mm inner diameter
DiI Invitrogen D-282  
Iron Reduced Mallinckrodt Baker Inc. 5320  
10 μm Diameter Microspheres (black) Polysciences Inc. 24294  
Delta T Dish (for time lapse culture) Bioptechs 04200415B 0.17mm thick, black
Delta T4 Culture Dish Controller Bioptechs 0420-4-03  
Mini-Pump Variable Flow Device Fisher Scientific    

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Cite This Article
Filas, B. A., Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo. J. Vis. Exp. (56), e3129, doi:10.3791/3129 (2011).

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