Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

מעקב אחר דפורמציות המוךפו"גנטי שהולך רקמות בעובר צ'יק מוקדם

doi: 10.3791/3129 Published: October 17, 2011

Summary

מאמר זה מתאר תיוג פני השטח

Abstract

עובריים epithelia לעבור דפורמציות מורכבים (למשל, כפיפה, פיתול, קיפול, מתיחה) לטופס איברים פרימיטיביים של העובר מוקדם. מעקב אחר סמנים fiducial על פני השטח של אלה גיליונות הסלולר היא שיטה מבוססת היטב להערכת כמויות המוךפו"גנטי שהולך כגון, צמיחה גזירה התכווצות,. עם זאת, לא כל תיוג טכניקות פני השטח הם להתאמה בקלות שיטות הדמיה קונבנציונאלי בעל יתרונות ומגבלות שונות. כאן, אנו מתארים שתי שיטות תיוג להמחיש את התועלת של כל טכניקה. בשיטה הראשונה, מאות תוויות ניאון מוחלים בעת ובעונה אחת לעובר באמצעות חלקיקי ברזל מגנטיים. תוויות אלה משמשים לאחר מכן כמות 2-D דפורמציות רקמות במהלך המורפוגנזה. בשיטה השנייה, פוליסטירן microspheres משמשים סוכנים בניגוד ב פולשני הדמיה טומוגרפיה אופטית (אוקטובר) כדי לעקוב אחר קוהרנטיות 3-D דפורמציות רקמות. טכניקות אלו הצליחוly מיושם במעבדה שלנו studythe המנגנונים הפיזיים של קיפול הראש בלב מוקדם, והתפתחות המוח, ויש להתאמה לתהליכים המוךפו"גנטי שהולך רחב טווח.

Protocol

1. הכנה ניסויית כללי

  1. הכן תרבות בינוני רקמות למכסה המנוע לזרום למינרית.
    1. מדולל בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) (1 בקבוק עם 4.5g L / L גלוקוז, סודיום ביקרבונט, ו-L-גלוטמין). הוסף 10 מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין / neomycin אנטיביוטיקה.
    2. הסרה של 100 מ"ל של DMEM עם טפטפת העברת סטרילי ולהחליף 100 מ"ל של חומוס בסרום.
    3. Aliquot הבחורה DMEM/10% בסרום / אנטיביוטיקה 1% תוך 15 בקבוקונים סטריליים חרוטי מ"ל ולהקפיא.
  2. הכן בופר פוספט (PBS) בתוספת סידן ומגנזיום. מערבבים 100 מ"ל PBS 10X, 900 מ"ל מים deionized, ו 1 מ"ל של תמיסת סידן ומגנזיום מרוכז (100 מ"ג / מ"ל CaCl 2 • 2H 2 O, 100mg/mL MgCl 2 • 6 שעות 2 O).
  3. דגירה הביצים אוריינטציה האורך לשלב הרצוי כפי שהוגדר על ידי המבורגר המילטון 1 (כלומר 23-25 ​​שעות בשלב HH 5 או 42-48 שעות בשלבים HH 11-12).
  4. הסר עוברים מן הביצה בשיטת מסנן המוביל נייר.
    1. קראק התחתון של הביצה בצד של צלחת פטרי a150 מ"מ. לפרק את המעטפת מלמטה ולרוקן את תוכן הביצה לתוך צלחת.
    2. הסר את עבה, צמיג חלבון מן הביצה באמצעות מלקחיים בוטה.
    3. חותכים עיגולים של Whatman # 2 נייר פילטר 2-3 ס"מ. קוטר. בעזרת חור אחד אגרוף, אגרוף חורים באמצע הנייר את המסנן. מקום אחד טבעות נייר לסנן החלמון באופן ששומר על העובר גלוי דרך חור מרכזי בזירה.
    4. חותכים סביב הקוטר החיצוני של העיתון עם מסנן microscissors. הסר את הנייר מן החלמון עם מלקחיים בסדר.
    5. לשטוף בעדינות את העובר ב PBS להסיר חלקיקים חלמון חסיד. (HH5 עוברים ייתכן שתצטרך לספוג עוד 15-20 דקות להסיר את שיירי חלמון). הסר את מכלול נייר לסנן באמבטיה ומניחים אותו בצד הגחון למעלה35 מ"מ תרבות צלחת. מניחים הטבעת השנייה על גבי נייר הסינון הראשון, הרבדה העובר בין הטבעות. לשים טבעת מתכת סביב החלק החיצוני של הכריך נייר פילטר (≈ 1.5-2 ס"מ קוטר) כדי להבטיח את העובר.
    6. להטביע את העובר במדיום תרבות. מורפולוגיה אמת נכונה בשלב העוברי עם מיקרוסקופ שדה בהיר.
  5. השתמש חולץ פיפטה להכין קנס זכוכית קצה המחטים (1.5 מ"מ קוטר פנימי) (Precision Instruments העולם, Sarasota פלורידה) עבור והניתוחים רקמה הבאים וסימון.

2. DiI תיוג של ה"ה שלב 5 עוברים באמצעות חלקיקי ברזל מגנטית

  1. הוסף כמה טיפות של DiI רווי אלכוהול בכמות קטנה של אבקת ברזל (ברזל מופחת, Mallinckrodt בייקר, Inc, Phillipsburg, NJ) בטמפרטורת החדר ולתת להתייבש. (זה בדרך כלל גורם חלקיקים העוגה יחד פעם אלכוהול התאדו.) השתמש קצה micropipette משך לשבור את חלקיקי ברזל בכבדות,ולהעבירם צינור microcentrifuge, ולשטוף אותם מספר פעמים ומכסים במים deionized.
  2. כדי תווית תאים ectodermal ב עובר שלב 5 HH, במקום לקצור את העובר (כלומר, מכלול שלם נייר פילטר) בצד הגבי על צלחת תרבות 35 מ"מ מכוסה בשכבה נדיבה של התקשורת בתרבות לשים את המנה תחת מיקרוסקופ לנתח. שימוש במחט זכוכית כדי להסיר את הקרום vitelline ולחשוף את התאים ectodermal. (תשמרי לעובר לנקב לא.)
  3. צייר עמודה של חלקיקי ברזל מסומן (במים deionized) לתוך פיפטה פסטר. שימוש בניתוח, לצלול מיקרוסקופ קצה פיפטה מתחת לפני השטח עמדה נוזלים מעל העובר. רולינג פיפטה לאט הלוך ושוב בין האצבעות, להדחף חלקיקים מתוך pipiette ומפזרים אותם על פני העובר.
  4. לאחר העובר מכוסה חלקיקים, בזהירות למקם אותו 37 מעלות באינקובטור במשך כ 10 דקות. קחו את העובר מתוך האינקובטורד להשתמש במגנט חזק כדי להסיר את חלקיקי.
  5. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מצלמת וידאו מצורף הגדרות המסנן המתאים לרכוש הן בתחום בהיר ותמונות הניאון של העובר, כפי שמוצג באיור 2 א, ב
  6. הערה צפיפות התווית. אם חלוקה צפופה הוא הרצוי, להשתמש חלקיקים נוספים (כמתואר לעיל) לתייג את העובר שוב להאריך את זמן הדגירה בהתאם. אם התוויות הם צפופים מדי, להוסיף כמות קטנה של חלקיקי ברזל ללא תווית אל הצינור microcentrifuge מלא חלקיקים שכותרתו כבר ומערבבים את תוכן הצינור. חזור על תהליך תיוג עם העובר חדש ושוב לציין צפיפות התווית.

3. Microsphere פוליסטירן תיוג עבור טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר) הדמיה של HH11-12 עוברים

  1. הכן פתרון של שחור בקוטר 10 מיקרומטר microspheres (Polysciences Inc, Warrington, PA) PBS בצלחת פטרי 35 מ"מ. (חרוזים צריך להיות גדול מספיק כדי ליצור ניגוד עבור אוקטוברהדמיה, אך קטן מספיק כך גודל חרוז הוא בסדר גודל של תאים בודדים. ערכים ספציפיים ישתנו בהתאם לרזולוציה של המערכת אוקטובר ואת רקמות הנלמד). טיפה אחת של פתרון המניות (2.6% מוצקים, לטקס) לכל מ"ל של PBS הוא בדרך כלל מספיקים. משוך את הפתרון הזה לתוך מזרק 10cc באמצעות מחט מד 22. הפתרון וורטקס למשך 30 שניות, כדי להבטיח חלוקה חרוז אחיד.
  2. שפוע קצות המחטים ומשך שלך זכוכית באמצעות הכונן הקשיח של המחשב 2. קוטר עצה צריך להיות גדול מספיק חרוזים יכול להתאים דרך הפתח, אבל באותו הזמן, קטן ככל האפשר כדי למזער ופצע רקמות במהלך ההזרקה.
  3. מלא מחט זכוכית משופעים עם פתרון חרוז באמצעות מזרק. קלות קפיצי micropipette על מנת להבטיח כי הפתרון הגיע קצה.
  4. שימוש micromanipulator, במקום מחט זכוכית באותו שדה הראייה כמו העובר. חרוזים צריך להיות זורם מתוך קצה פיפטה.
    1. אם לא ביהDS היציאה micropipette, ייתכן שיש לסתום. במקרה זה, חזור על שלבים 3.2-3.4 עם מחט זכוכית חדשה.
    2. אם חרוזים יותר מדי ענן שדה הראייה שלכם, קצה פיפטה שלך עשוי להיות רחב מדי. חזור על שלבים 3.2-3.4 עם טפטפת חדשה העובר החדש.
  5. הכנס את קצה פיפטה לתוך לומן של הצינור המוח. הקפד לא לחדור הרצפה הגחון של הרקמה. תראה נפיחות חולפת של רקמת חרוזים כמו נוזל להיכנס לומן. דבר זה מצביע על אינטובציה מוצלחת, עכשיו, מהר להוציא את המחט זכוכית.
  6. בדיקת צפיפות חרוז מספיק לומן הפנימי של הצינור המוח באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. בואו החרוזים להתיישב במשך 20 - 30 דקות לפני שתמשיך כת. 4.

4. Data Acquisition

* השיטות הבאות גם מתאים הטכניקה תיוג הקרינה שתוארו לעיל. עם זאת, עם הטכניקה תיוג microsphere, חרוזים יכולים לעקור בעת העברת דגימותבין החממות מערכות הדמיה. במקרה זה עדיף לשלב 4.2 (אשר ימנע מדגם תנועה / תסיסה לגמרי). בשתי השיטות, הם עוברים בתרבית תוך שקוע בינוני תרבות נוזלי. אם העובר אינו שקוע לחלוטין (כמו במקרה עם כמה טכניקות קונבנציונאלי תרבות רקמות), גיאומטריה רקמות משתנה במידה רבה על ידי מתח גבוה באופן חריג המון השטח הפצות זן ייכשל כדי ללכוד במדויק המורפוגנזה נורמלי 3-D 3, 4. יתר על כן, והטביע את הרקמה מונעת בניגוד בהיר שנצפה ממשק נוזל לגז במהלך אוקטובר הדמיה של טשטוש מורפולוגיה עובריים קואורדינטות הסמן.

  1. העובר תרבות (כללי)
    1. לאחר רכישת התמונות הראשונות שלך (שדה בהיר, פלואורסצנטי, או אוקטובר), לשים עד שבע 35 תרבות מנות מ"מ (עם עוברי) בצלחת פטרי 150 מ"מ מקום ההרכבה כולה בשקית ניילון קטנה. הוסף כמה טיפות מים deionized לשקית עבור humidificationולמלא את השקית עם 95% O 2 / 5% 2 CO תערובת. מניחים את העוברים לתוך החממה ב 37 ° C (Queue Stabiletherm, אשוויל, צפון קרוליינה) בפעם הרצוי עד הבא הדמיה timepoint. באמצעות שיטה זו, ניתן לבצע ניסויים על עוברים מרובים באותו יום.
  2. זמן לשגות תרבות (אוטומטית)
    1. המקום עוברים שכותרתו שלך לתוך צלחת דלתא T (35 מ"מ קוטר חיצוני, 23 מ"מ צמצם מרכזי עם הקיר בצד קוני, זכוכית עבה 0.17mm; Bioptechs, באטלר, הרשות הפלסטינית) המכיל 1.2 מ"ל של מדיום תרבות.
    2. מכסים את צלחת עם מכסה זכוכית שמר על 37 מעלות צלזיוס באמצעות דלתא Bioptechs תרבות T4 תבשיל בקר (כדי למנוע התעבות). Superfuse את העובר עם 95% O 2 / 5% CO 2 גז תערובת שסופקו מכשיר ה-Mini-Pump משתנה זרימה (פישר סיינטיפיק). לפני שהגיע העובר, חום ללחלח את הגז על ידי זה מבעבע דרך המים deionized על חם (<100 ° C) צלחת חמה. סכימטי של של הניסוי הזהet-up מוצג באיור 1.
    3. הגדרת את התוכנה באופן אוטומטי לרכוש תמונות על המשתמש שצוין מרווחי זמן. עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי שלנו, אנו משתמשים Openlab תוכנה (PerkinElmer, Waltham, MA), ועל המערכת שלנו אוקטובר, אנו משתמשים נסחף מקור Thorlabs תוכנה (ניוטון, NJ). בגלל שיטה זו היא כיום מסוגל רק לטיפול חד פעמי לשגות הניסוי ב פעם, לעתים קרובות הטוב ביותר כדי לאפשר סוגים אלה של תרבויות לרוץ לילה. אפשר לעקוף מגבלה זו על ידי התקנת שלב לתרגום אוטומטי תואם חומרה והן תוכנה של מערכת הדמיה 5.

5. נציג תוצאות:

תוויות מאותרים באופן אוטומטי (באמצעות Volocity, PerkinElmer) או באופן ידני (באמצעות תוסף מעקב ידני ImageJ, NIH) בניסוי זה. בטכניקה תיוג פלורסנט, אנו משתמשים gridfit שגרתי Matlab כדי להתאים משטחים 2D באמצעות קואורדינטות הסמן, אשר מאפשרת זנים המוךפו"גנטי שהולך משטח שיש לחשב 6, 7. משוואות תקן משמשים כדי להפוך את הערכים הללו לתוך מערכת קואורדינטות רלוונטי עובריים. לחלופין, בטכניקת אוקטובר, משטחים נוצרות מתוך כרכים התמונה מפולח (המתקבל באמצעות תוכנה סטנדרטיים כגון Matlab או קארה 8) ו זנים ניתן לחשב בכיוון של עקמומיות המקסימלית או מינימום של המדגם 9.

השתמשנו חלקיק הברזל שלנו טכניקה לתייג ולעקוב אחר תנועה של תאים ectodermal במהלך היווצרות הראש פי העובר גוזל מוקדם. כמתואר בתרשים 2A, תאים שכותרתו fluorescently הופצו ברחבי העובר כולו. השדה מואר ותמונות הניאון של העובר נתפסו במרווחים שונים במהלך התרבות אובו לשעבר. ההצעות של תוויות מעקב (איור 2 ב, ג) שימשו לחישוב המתח המוךפו"גנטי שהולך ומתפתח הפצות במהלך היווצרות הראש לקפל (איור 2D-F).

t "> בדומה, microsphere פוליסטירן שלנו טכניקה ששימשה כדי לעקוב אחר תנועות הרקמה בגבול אמצע למוח האחורי של המוח חומוס מוקדם. כפי שניתן לראות בתרשים 3 BD, תנועות חרוז היו במעקב במשך 6 שעות ו זנים המאפיינת דפורמציה רקמה האורך ו כיוונים ההיקפי חושבו מתוך קואורדינטות הסמן. שים לב כי בשיטה זו הוא מסוגל הטיפול בבירור 3-D דפורמציות כמו חרוזים נוטים לדבוק כל הצדדים של לומן הפנימי של המוח (איור 3A).

איור 1
באיור 1. סכמטי של הגדרת לתרבות זמן לשגות רקמות.

איור 2
באיור 2. כימות 2-D דפורמציות רקמות בעובר האפרוח מוקדם באמצעות תוויות ניאון במעקב. (א) בהיר שמוזגו שדה / פלורסנט התמונה של העובר בשלב HH 5 לאחר הסרת חלקיקי ברזל. DiI-labelעורך תאים ectodermal (אדום) מופצים ברחבי העובר כולו. (B, C) תנועה של תאים שכותרתו היתה מעקב באמצעות ImageJ. התקות לייבל חושבו קואורדינטות העובר (X, Y). שים לב, A ו-B הן אותה תמונה. (DF) מגרשים קונטור של הפצות מתפתח זן אורכית במהלך היווצרות הראש לקפל. אורך זנים Lagrangian חושבו ביחס HH שלב 5 (כלומר, A ו-B) אחרי 75 דקות (ד), (E) 120 דקות, ו - (F) 165 דקות של דגירה. זנים אלו לאפיין את השינויים באורך של אלמנטים קו אוריינטציה במקור לאורך ציר ה-Y (בעובר בשלב 5). פרטים נוספים על התווית באמצעות מעקב אחר נקודות ציון לחשב זנים המוךפו"גנטי שהולך ניתן למצוא Filas et al. (2007) 6 ו Varner et al. (2010) 7. שים לב, C ו-F הן אותה תמונה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר.

איור 3
באיור 3. כימות 3-D רקמה דeformations במוח הגוזל מוקדם. (א) פוליסטירן microspheres כי לדבוק (חץ שחור) הגבי ו הגחוני (חץ לבן) צידי הצינור המוח להבחין בקלות סביב הרקמות רוחבי צפיות section.Ventral צלב של שחזורים אוקטובר להראות במקומות microsphere ליד גבול למוח האחורי באמצע ב (ב) HH12 ואחרי (ג) 6 שעות של דגירה (M: המוח התיכון, H: למוח האחורי). מספר קבוצות של חרוזים המפורטות כדי להדגיש את העיוות הכולל של הרקמה. (ד) אורך (E zz) ו היקפיים (E θθ) זנים Lagrangian חושבו מתוך עיוותים אלה. חיובי זנים ההיקפי האורך ושליליות בגבול אמצע למוח האחורי משקפים צירית הארכת וקיצור ההיקפי של אזור זה במהלך התרבות. פרטים נוספים על חישוב זנים המוךפו"גנטי שהולך על משטחים מורכבים במהלך המורפוגנזה ניתן למצוא Filas et al. (2008) 9. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שני תיוג טכניקות רקמה מוצגים לתרבות אובו לשעבר של עוברים חומוס מוקדם. הראשונה משתמשת בצבעי ניאון lipophilic שיישלח באמצעות חלקיקי ברזל מגנטי בו זמנית תווית מאות תאים. עם זאת, שיטה זו היא כיום אינו תואם טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית, כמו צבעי ניאון בדרך כלל להראות בניגוד מעט מן הרקמות הסובבות באמצעות אוקטובר 10. לפיכך, אנו מציגים טכניקה חלופית באמצעות קלקר microspheres לתייג רקמות לניתוח אוקטובר זמן לשגות. טכניקה זו מניבה מערכי נתונים 3-D, אך יש להקפיד לא כדי לסלק את החרוזים מן הרקמה. שימוש או באחת השיטות הבאות במסגרת הניסוי המתאים אמור לספק תיוג רקמות אמין ופיתוח אובו לשעבר עוברי מוקדם. שתי השיטות משתמשים זמינים, יחסית בעלות נמוכה חומרים (למשל, אבקת ברזל, קלקר microspheres) ולאפשר דפורמציה רקמות לכימות במהלך המורפוגנזה.סמני רקמות בשני המקרים ניתן בקלות reproducibly להחיל רקמות עובריים ואינם דורשים ציוד מיוחד, מה שהופך את הניסויים הללו הנגישות לאנשים חדשים בתחום. הדמיה וניתוח הנתונים המתקבלים (למשל, על ידי מפות מחשוב המוךפו"גנטי שהולך זן) אמור לעזור להאיר את המכניקה של המורפוגנזה במערכת המודל שלך 6, 7, 9, 11, 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים GM075200 R01 ו R01 HL083393 (LAT). אנו מכירים תמיכה המילגה עבור BAF מ NIH T90 DA022871 ומכון Mallinckrodt לרדיולוגיה, ועל VDV מ 09PRE2060795 מענק מאיגוד הלב האמריקני.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM — high glucose Sigma-Aldrich D5796
Penicillin/Streptomycin/Neomycin Sigma-Aldrich P4083
Chicken Serum Invitrogen 16110-082
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D1408 10X
Whatman #2 Filter Paper Whatman, GE Healthcare 1002 090 90mm diameter
Glass Micropipettes World Precision Instruments, Inc. TW150-6 1.5mm inner diameter
DiI Invitrogen D-282
Iron Reduced Mallinckrodt Baker Inc. 5320
10 μm Diameter Microspheres (black) Polysciences, Inc. 24294
Delta T Dish (for time lapse culture) Bioptechs 04200415B 0.17mm thick, black
Delta T4 Culture Dish Controller Bioptechs 0420-4-03
Mini-Pump Variable Flow Device Fisher Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
  2. Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
  3. Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces. Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).
  4. Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia. Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).
  5. Kozel, B. A. Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).
  6. Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart. Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).
  7. Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development. Development. 137, 3801-3811 (2010).
  8. Van Essen, D. C. An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex. J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).
  9. Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis. J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).
  10. Yuan, S. Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging. Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).
  11. Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).
  12. Blanchard, G. B. Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation. Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).
מעקב אחר דפורמציות המוךפו&quot;גנטי שהולך רקמות בעובר צ&#39;יק מוקדם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Filas, B. A., Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo . J. Vis. Exp. (56), e3129, doi:10.3791/3129 (2011).More

Filas, B. A., Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo . J. Vis. Exp. (56), e3129, doi:10.3791/3129 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter