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Biology

CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV

doi: 10.3791/315 Published: October 1, 2007

Summary

Protocol

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  1. Bereiten mikrofluidischen Kanal mit anti-CD4 + biotinlayted Oberfläche.
  2. Injektion von 10 ml Probe Blut bei 5 ml / min in den mikrofluidischen Kanal mit Spritzenpumpe.
  3. Spülen Sie das Blut bei 20 ml / min für 20 min mit PBS.
  4. Inject verdünnt FACS Lyse-Lösung (verdünnt auf 10% von Stammlösung mit PBS) bei 5ul/min für 15 min.
  5. Inkubation: 15 min.
  6. Inject primären CD3 +-Antikörper-Lösung (verdünnt auf 10% von Stammlösung mit PBS) bei 5 ml / min für 20 min.
  7. Inkubieren für 2 Stunden.
  8. Spülen Sie Kanal mit PBS auf 5 ml / min für 15 min.
  9. Inject 20% AF488 CD4 +-Antikörper, 0,2% DAPI-Stammlösung und 10% sekundäre CD3 + Antikörper bei 5 ml / min für 20 min zur gleichen Zeit.
  10. Inkubieren für 20 min.
  11. Spülen Sie den Kanal mit PBS auf 5 ml / min für 15 min.
  12. Zählen von Zellen unter Fluoreszenzmikroskop:
    1. White (optisch) - Schwarz und Weiß: Zell-und Staub
    2. UV (DAPI) - Blue: Zelle nur
    3. Blue (CD4 +) - Grün: T-Lymphozyten und Monozyten
    4. Green (CD3 +) - Rot: T-Lymphozyten nur

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS microchannel Fabricated by SU-8 mold
Blood Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital.
PBS Buffer Invitrogen 14190 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline.
FACS lysing solution BD Biosciences 349202 Diluted to 10% from stock solution with PBS.
Anti-CD4+ biotinlayted Ab Beckman Coulter Inc. IM0704 Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water.
goat anti-hCD3delta pAB Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-1128 Diluted to 10% from stock solution with PBS
rabbit anti-goat IgG PE Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-3755 Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS
anti-human CD4+ BD Biosciences 557695 Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS.
DAPI Invitrogen D1306 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS.

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Moon, S. J., Lin, R., Demirci, U. CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV. J. Vis. Exp. (8), e315, doi:10.3791/315 (2007).More

Moon, S. J., Lin, R., Demirci, U. CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV. J. Vis. Exp. (8), e315, doi:10.3791/315 (2007).

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