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Biology

+ टी lymphocyte कैद CD4 एचआईवी के लिए एक डिस्पोजेबल microfluidic चिप का उपयोग

doi: 10.3791/315 Published: October 1, 2007

Summary

Protocol

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  1. विरोधी - CD4 + biotinlayted सतह के साथ microfluidic चैनल तैयार है.
  2. 5 मिलीलीटर / मिनट में नमूना रक्त के 10 मिलीलीटर सिरिंज पंप के साथ microfluidic चैनल में इंजेक्षन.
  3. पीबीएस के साथ 20 मिनट के लिए / 20 मिलीलीटर मिनट पर खून फ्लश.
  4. 5ul/min पर 15 मिनट के लिए पतला FACS lysing समाधान (पीबीएस साथ शेयर समाधान से 10% करने के लिए पतला) इंजेक्षन.
  5. 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  6. 5 मिलीलीटर / 20 मिनट के लिए मिनट पर प्राथमिक CD3 + एंटीबॉडी समाधान (पीबीएस साथ शेयर समाधान से 10% करने के लिए पतला) इंजेक्षन.
  7. 2 घंटे के लिए सेते हैं.
  8. 5 मिलीग्राम / 15 मिनट के लिए मिनट में पीबीएस चैनल के साथ बाहर फ्लश.
  9. 5 / मिलीलीटर मिनट पर एक ही समय में 20 मिनट के लिए 20% AF488 सीडी 4 + एंटीबॉडी, 0.2% DAPI शेयर समाधान, और 10% माध्यमिक CD3 + एंटीबॉडी सुई .
  10. 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  11. 5 मिलीग्राम / 15 मिनट के लिए मिनट में पीबीएस चैनल के साथ बाहर फ्लश.
  12. फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की गणना:
    1. (ऑप्टिकल) सफेद - काले और सफेद: सेल और धूल
    2. (DAPI) यूवी - केवल ब्लू: सेल
    3. ब्लू (सीडी 4 +) - ग्रीन: टी लिम्फोसाइट और monocyte
    4. ग्रीन (CD3 +) - केवल लाल: टी lymphocyte

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS microchannel Fabricated by SU-8 mold
Blood Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital.
PBS Buffer Invitrogen 14190 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline.
FACS lysing solution BD Biosciences 349202 Diluted to 10% from stock solution with PBS.
Anti-CD4+ biotinlayted Ab Beckman Coulter Inc. IM0704 Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water.
goat anti-hCD3delta pAB Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-1128 Diluted to 10% from stock solution with PBS
rabbit anti-goat IgG PE Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-3755 Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS
anti-human CD4+ BD Biosciences 557695 Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS.
DAPI Invitrogen D1306 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS.

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Moon, S. J., Lin, R., Demirci, U. CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV. J. Vis. Exp. (8), e315, doi:10.3791/315 (2007).More

Moon, S. J., Lin, R., Demirci, U. CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV. J. Vis. Exp. (8), e315, doi:10.3791/315 (2007).

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