En metod beskrivs för att photoactivate enskilda celler innehållande en bur fluorescerande protein med två-foton-absorption från en Ti: Sapphire femtosecond laseroscillatorn. För ödet karta fotoaktiverad cell, immunohistokemi används. Denna teknik kan tillämpas på varje celltyp.
Förmågan att differentiellt märka enstaka celler har viktiga följder i utvecklingsbiologi. Till exempel bestämma hur hematopoetiska, lymfatiska och blodkärl linjer uppstår i utvecklingen embryon kräver öde kartläggning och härstamning spårning av odifferentierade prekursorceller. Nyligen fotoaktiverbara proteiner som inkluderar: har Eos 1, 2, PAmCherry 3, Kaede 4-7, pKindling 8 och KikGR 9, 10 fick stor intresse som cell spåra prober. Fluorescensspektrumet för dessa ljuskänsliga proteiner kan lätt omvandlas med UV-excitering, tillåter en population av celler som skall särskiljas från intilliggande. Emellertid kan photoefficiency av den aktiverade proteinet begränsar långvarig cell spårning 11. Som ett alternativ till fotoaktiverbara proteiner, bur fluorescein-dextran har använts i stor utsträckning i system embryo modell 7, 12-14. Traditionellt, att uncage fluorescein-dextran, UV spännandetion från en fluorescens-lampa hus eller en enda foton UV-laser har använts, men sådana källor begränsar den rumsliga upplösningen i fotoaktivering. Här rapporterar vi ett protokoll till öde karta, härstamning spår, och upptäcka enstaka märkta celler. Enstaka celler i embryon som injicerats med bur fluorescein-dextran fotoaktiveras med nära-infraröda laserpulser som framställts av en titan safir femtosecond laser. Denna laser är brukligt i alla två-photon konfokala mikroskop som LSM 510 META NLO mikroskop som används i detta dokument. Eftersom biologisk vävnad är transparent för nära infraröd strålning 15, kan laserpulserna fokuseras djupt inne i embryot utan uncaging celler över eller under den valda fokalplanet. Därför är icke-linjär två-fotonabsorption inducerade endast vid den geometriska fokus uncage fluorescein-dextran i en enda cell. För att upptäcka den cell som innehåller Uncaged fluorescein-dextran, beskriver vi en enkel immunohistokemi protokoll 16 för att snabbt visuaLize den aktiverade cellen. Aktiveringen och upptäckt protokoll som presenteras i denna uppsats är mångsidig och kan tillämpas på alla modellsystem.
Obs: De reagens som används i detta protokoll kan hittas i tabellen bifogad i slutet av artikeln.
Detta dokument beskriver en mångsidig metod för en enda cell öde kartläggning baserad på fotoaktivering av bur fluorescein-dextran. Uncaging av bur fluorescein-dextran i enstaka celler sker med hjälp av två-foton absorption från en Mai Tai femtosecond laser kopplad till Zeiss LSM 510 META konfokalmikroskop. Uncaged fluorescein-dextran i fotoaktiverade celler är snabbt visualiseras med hjälp av en enkel immunhistokemi förfarande.
I detta protokoll de två-foton absorptionsvåglängd för fotoaktivering av bur fluorescein-dextran är 740 nm. Denna våglängd bestämdes experimentellt genom fotoaktiverande bur fluorescein-dextran injicerats vildtyp embryon. Lasern excitationsvåglängd varierades från 600 till 800 nm, och närvaron eller frånvaron av fluorescein fluorescens efter aktivering kvalitativt bestämdes. Vi fann att 740 nm producerade den starkaste fluorescein signalen efter aktivering. Helst bör 740 nm fungera för allamodellsystem, men råda vi testa ett intervall av våglängder för att bestämma den optimala tvåfotonexcitering våglängd för ditt prov.
I bur fluorescein-dextran injicerade vildtyp embryon för varje tvåfotonexcitering våglängd testade vi också varierade den genomsnittliga lasereffekten. För en excitationsvåglängd av 740 nm, en genomsnittlig lasereffekt av 47 mW gav en starkare fluorescein signal vid den aktiverade regionen i jämförelse med lägre genomsnittliga lasereffekter. Högre genomsnittliga lasereffekter producerade inte starkare fluorescein signaler, men inducerade ablation av vävnaden. Eftersom femtosecond laserpulser är effektiva på abiadering biologisk vävnad 15, rekommenderar vi att bestämma tröskeln power genomsnittliga laser för fotoaktivering som undviker vävnad ablation.
Två-foton absorption sker inom en liten interaktion volym. För att säkerställa korrekt aktivering av inburat fluorescein-dextran, måste cellen bringas i rätt fokus. I the ovanstående protokoll var GFP-positiva celler samtidigt avbildas under vitt ljus för att bekräfta cell fokus. Därför, vitt ljus förvärv förutom andra kanaler är tillrådligt. När du har bekräftat cell fokus föreslår vi protokoll förstoringsglas den aktiverade cellen. En zoom faktor på 50 till 70 föreslås emellertid, beror detta värde på storleken av den valda cellen. Ökning av zoomen isolerar den aktiverade cellen från intilliggande celler, och begränsar skanningsområdet för två-foton-aktivering. Helst ska skanningsområdet täcka ett stort område av cellen.
Detektion av enstaka aktiverade celler kräver att bakgrundsfärgning vara minimal. I ovanstående immunodetektion protokollet är det viktigt att provet är blockerad i blockeringsbuffert under 5 till 6 timmar (steg 4,13). När man utvecklar med NBT / BCIP bör Uncaged fluorescein-dextran bli synliga i 10 till 20 minuter. Om bakgrundsfärgning är stark, föreslår vi en längre blockerar tid och ytterligare tvättar för att avlägsna antikropp (steg 4,17).
Figur 1 och 2 ger representativa resultat av fotoaktivering och immunodetektion. I figur 1, tidigt 1 – till 2-cellstadiet vildtyp embryon injicerades med bur fluorescein-dextran. Embryona höjdes till mitten somitogenesis och monterade i lågsmältande agaros i den laterala orienteringen. Figur 1 (a, b) visar ljusfält och fluorescerande bilder av embryot före fotoaktivering. Bevis att embryot förblev Uncaged visas genom frånvaron av fluoresceinfluorescens i figur 1 (b). En liten region inom en somit aktiverades med en våglängd av 740 nm för 31 sekunder med användning av en genomsnittlig lasereffekt av 47 mW, fig. 1 (c, pil). Efter aktivering, två-foton uncaging av fluorescein-dextran inträffat som framgår av fluorescensen från det aktiverade området, Figur 1 (d, pil). Aktivering åtföljdes inte av laserablation, som somitic vävnaden förblev intakt, figur 1 (c). Figur 2 visar immunodetektion av Uncaged fluor escein-dextran. En liten region i den laterala plattan mesoderm av en 10-somit steget embryot fotoaktiveras användning av samma laser parametrar som nämns i figur 1. Embryot höjdes och bearbetas med steg 4,1 till 4,20. Pilen i fig. 2 lokaliserar regionen aktiverad, såsom indikeras genom ackumulering av blå fällning. Endast aktiverade läget är klart upptäcks utan att störa bakgrundsfärgning.
Beredning av lösningar:
1 X PBT (1 L)
100 ml 10 X PBS
2 g BSA
10 ml 20% Tween
10 X PBS (1 L)
80 g NaCl
2 g KCl
6,1 g Na 2 HPO 4
1,9 g KH 2 PO 4
DDH 2 O till 1 L
pH till 7,3
4% paraformaldehyd (160 ml)
32% Paraformaldehyd (två 10 ml flaskor)
8 ml 20 X PBS
132 ml DDH 2 O
Antikroppslösning (för 1 prov)
5,5 pl Aceton pulver
40 il PBT
0,8 pl LS
0,1 pl anti-fluorescein-AP-antikropp
2% LS (360 pl för 1 prov)
7,2 pl 100% LS
352,8 il PBT
1 X Danieau medium (1 L) ‡
11,6 ml 5 M NaCl
700 pl 1 M KCl
400 ul 1 M MgSO 4
600 pl 1 M Ca (NO 3) 2
5 ml 1 M HEPES
DDH 2 O till 1 L
pH justeras till 7,6
‡ Danieau är en idealisk saltlösning för uppfödning dechorionated zebrafisk embryon. Andra media kan användas, förutsatt att de är isotona lösningar med proPerly osmolaritet (~ 300 mOsm för zebrafisk)
NBT lager (1 ml)
50 mg nitroblåttetrazolium
0,7 ml dimetylformamid anhydrid
0,3 ml DDH 2 O
BCIP lager (1 ml)
50 mg 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat
1 ml dimetylformamid anhydrid
NBT / BCIP framkallningslösningen
1 ml AP-buffert
4,5 pl NBT lager
3,5 pl BCIP lager
Acetonpulver
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar J. Chen för att tillhandahålla bur fluorescein-dextran syntesprotokollet. Denna forskning stöddes av March of Dimes utmärkelse 5-FY09-78, American Heart Association utmärkelse 09BGIA2090075 och NIH / NHLBI utmärkelse R01 HL107369-01 SS Ett särskilt tack till C. Closson för hans mikroskopi hjälp.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 |
10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 |
Zeba Desalt Spin Column | Pierce | 89889 |
Low melting agarose | Amresco | 0815-100G |
Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G |
Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A |
Anti-fluorescein-AP | Roche | 11376622 |
Blocking buffer | Roche Applied Sciences | 11 096 176 001 |
Maleic Acid | Sigma | MO375-500G |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 |
NBT | Sigma | I8377-250mg |
BCIP | Fischer Scientific | PI-34040 |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 |
LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc International | 155380 |
Proteinase K | Invitrogen | AM2544 |
Lamb serum | Invitrogen | 16070096 |
LSM 510 META NLO | Zeiss | |
20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Zeiss | |
Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |