Dit is een methode om leukocyt adhesie te visualiseren aan het endotheel in geoogste drukvaten. De techniek maakt het bestuderen van vasculaire adhesie onder afschuiving stroom met verschillende intraluminale druk tot 200 mmHg aldus de pathofysiologische omstandigheden van hoge bloeddruk na te bootsen-ing.
Wereldwijd, hypertensie is naar verluidt in ongeveer een kwart van de bevolking en is de toonaangevende biomedische risicofactor voor mortaliteit wereldwijd. In het vaatstelsel hypertensie wordt geassocieerd met endotheliale dysfunctie en verhoogde ontsteking leidt tot atherosclerose en diverse ziektebeelden zoals chronische nierziekte 2, beroertes 3 en hartfalen 4. Een eerste stap in het vasculaire ontsteking leidt tot de atherogenese is de hechting cascade die de rollen, tethering, naleving en de daaropvolgende transmigratie van leukocyten door het endotheel inhoudt. Werving en accumulatie van leukocyten aan het endotheel wordt bemiddeld door een opregulatie van adhesie moleculen zoals vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellulaire cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) en E-selectine en toename van de cytokine en chemokine vrijkomen en een opregulatie van reactieve zuurstof species 5. In vitro-methoden zoals statische hechting testen helpen om mechanismen die betrokken zijn in cel-cel adhesie, alsook de analyse van celadhesie-moleculen te bepalen. Methoden die in eerdere in vitro studies hebben aangetoond dat acute stijging van de druk op het endotheel kan leiden tot monocyten hechting, een opregulatie van adhesiemoleculen en inflammatoire markers 6 echter, vergelijkbaar met een groot aantal in vitro-testen, deze bevindingen zijn niet uitgevoerd in real-time onder fysiologische omstandigheden stroom, noch met volbloed. Daarom worden in vivo testen steeds meer gebruikt in diermodellen om vasculaire ontsteking en plaque ontwikkeling aan te tonen. Intravitale microscopie is nu op grote schaal gebruikt om de leukocyten adhesie, walsen, migratie en transmigratie 7-9 te beoordelen. Bij het combineren van de effecten van de druk op de leukocyten aan endotheel adhesie van de in vivo studies zijn minder uitgebreid. Een van deze studie onderzoekt de real-time effecten van de flow en afschuiving op arteriële groei en remodeling, maar inflammatoire markers werden alleen beoordeeld via immunohistochemie 10. Hier presenteren we een model voor het opnemen van leukocyten adhesie in real time in intacte onder druk bloedvaten met behulp van volbloed perfusie. De methodiek is een wijziging van een ex vivo schip kamer perfusie model 9, die real-time analyse van leukocyt-endotheliale lijm interacties in intacte schepen mogelijk maakt. Onze aanpassing maakt de manipulatie van de intraluminale druk tot 200 mmHg waardoor studeren niet alleen onder fysiologische stroming, maar ook druk omstandigheden. Terwijl de druk myography systemen zijn eerder aangetoond dat vaatwand en lumen diameter 11 en schip krimp zien is dit de eerste keer tonen leukocyten-endotheel interacties in real time. Hier laten we zien de techniek met behulp van halsslagaders geoogst van ratten en gecanuleerde om een custom-made stroom kamer gekoppeld aan een fluorescentiemicroscoop. Het schip kamer is uitgerust met een groot dekglaasje bodem waardoor een grote diameter objectief met een korte werkafstand om de afbeelding van het schip. Bovendien kunnen geselecteerde agonist en / of antagonisten worden gebruikt om verder te onderzoeken van de mechanismen die celadhesie. Voordelen van deze methode meer dan intravitale microscopie zijn geen betrokkenheid van invasieve chirurgie en dus een hogere doorvoersnelheid kan worden verkregen. Deze methode maakt het ook mogelijk het gebruik van gelokaliseerde remmer behandeling om de gewenste schip terwijl intravitale alleen mogelijk systemische remmer behandeling.
Dit is een aangepaste methode om leukocyt adhesie studeren aan het endotheel in intacte geïsoleerde bloedvaten onder druk omstandigheden in real time. Perfusie van het schip kamer alleen al maakt een snelle validatie van pro-inflammatoire stammen van de grote muizen en ratten schepen. Waardoor de druk manipulatie laat dynamische cel interacties in acht te nemen van laag tot zeer hoog intraluminale druk, dus beter na te bootsen-ing fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Diameter van de schepen kan ook worden gemeten met behulp van een voldoende cell-imaging-programma, zodat shear flow en snelheid kan worden bepaald en dus gemanipuleerd.
Met zijn myograph mogelijkheden, farmacologische interventies in het bad nog een dimensie toe aan de experimentele omstandigheden mogelijk met dit model mogelijk studies van de mechanistische en signaalwegen. Terwijl endotheel bewaring kan niet worden bevestigd tijdens de druk van manipulatie, kunnen reacties op ACh en PE worden uitgevoerd na de perfusie 9.
Opgemerkt moet worden dat deze opzet de effecten van de intraluminale druk op de cel-tot-cel interacties niet de effecten van de pulsatiele bloedstroom, noch systolische of diastolische druk toont. Bovendien, terwijl de druk acute veranderingen op leukocyt adhesie werden waargenomen, kan deze setup ook worden gebruikt om te kijken naar chronische druk-effecten (namelijk het vergroten incubatietijden en het gebruik van een chronische druk diermodel). Sprague Dawley gemeenschappelijke halsslagaders worden gedemonstreerd in deze set-up maar ook andere stammen en diersoorten kunnen worden gebruikt met de nodige aanpassingen aan de canule maat. Inderdaad, is het belangrijk op te merken dat de leeftijd en het gewicht van de dieren grootte van het vaartuig van invloed zijn en dus dat de set-up moet worden geïndividualiseerd voor elk vaartuig. Sluiten en een zorgvuldige dissectie van het bindweefsel kan verbeteren visualisatie van leukocyten enorm.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd mede ondersteund door OIS de Victoriaanse regering Program, de National Health en Medical Research Council van Australië programma en projectsubsidies (JPF Chin-Afstoffen) en de postdoctorale beurs (D Michell).
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Microscope | Carl Zeiss, Inc | SteREO Discovery V.20 | |
PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
Digital Camera and Controller | Hamamatsu ORCA-ER | C4742-95 | |
Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS – 200 | |
Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM – 4 | |
2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT – F | |
Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |