Este é um método para visualizar a adesão de leucócitos ao endotélio em vasos pressurizados colhidas. A técnica permite estudar de adesão vascular sob fluxo de cisalhamento com diferentes pressões intraluminal até 200 mmHg, assim, imitam-ing as condições fisiopatológicos da pressão arterial elevada.
Hipertensão, em todo o mundo é relatado para ser em aproximadamente um quarto da população e é o principal fator de risco para mortalidade no mundo biomédico. Na vasculatura hipertensão está associada com disfunção endotelial e aumento da inflamação levando à aterosclerose e várias doenças, tais como doença renal crônica 2, 3 derrame e insuficiência cardíaca 4. Um passo inicial na inflamação vascular levando a aterogênese é a cascata de adesão que envolve o rolamento, tethering, a adesão ea transmigração de leucócitos subseqüentes através do endotélio. Recrutamento e acúmulo de leucócitos ao endotélio é mediada por uma regulação alta de moléculas de adesão, como a molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1), molécula de adesão celular intracelular-1 (ICAM-1) e E-selectina, bem como aumentos nos citocinas e quimiocinas libertação e uma regulação alta de espécies reativas de oxigênio 5. Os métodos in vitro, tais como testes de aderência estática ajudar a determinar os mecanismos envolvidos na adesão célula a célula, bem como a análise de moléculas de adesão celular. Métodos utilizados nos anteriores estudos in vitro demonstraram que aumentos agudos de pressão sobre o endotélio pode levar a adesão de monócitos, um upregulation de moléculas de adesão e de marcadores inflamatórios 6 no entanto, semelhante a muitos ensaios in vitro, esses achados não foram realizados em tempo real sob condições de fluxo fisiológico, nem com sangue total. Portanto, em ensaios in vivo são cada vez mais utilizados em modelos animais para demonstrar inflamação vascular eo desenvolvimento de placa. Microscopia intravital é agora amplamente utilizados para avaliar a adesão de leucócitos, migração, rolamento e transmigração 7-9. Ao combinar os efeitos da pressão sobre os leucócitos para a adesão endotelial estudos in vivo são menos extensas. Um desses estudos examina os efeitos em tempo real do fluxo e cisalhamento sobre o crescimento arterial e marcadores inflamatórios remodelação, mas só foram avaliados através de imuno-histoquímica 10. Aqui apresentamos um modelo para a gravação de adesão leucocitária em tempo real no intacta vasos sanguíneos sob pressão de perfusão utilizando sangue total. A metodologia é uma modificação de um navio vivo ex-modelo de perfusão câmara 9, que permite a análise em tempo real das interações leucócito-endotélio adesivo em vasos intactos. Nossa modificação permite a manipulação da pressão intraluminal até 200 mmHg permitindo estudo não somente sob condições de fluxo fisiológico, mas também condições de pressão. Enquanto os sistemas Miografia pressão tenham sido previamente demonstrado para observar parede do vaso e do lúmen diâmetro 11, bem como a contração este vaso é a primeira vez demonstrando interações leucócito-endotélio em tempo real. Aqui nós demonstrar a técnica usando artérias carótidas de ratos colhidos e canulada a uma câmara de fluxo custom-made acoplado a um microscópio de fluorescência. A câmara de embarcação está equipada com uma lamela grande fundo permitindo uma lente objetiva de grande diâmetro, com distância de trabalho de curto para a imagem do navio. Além disso, agonista selecionados e / ou antagonistas podem ser utilizados para investigar os mecanismos que controlam a adesão celular. Vantagens deste método sobre microscopia intravital não incluem o envolvimento de cirurgia invasiva e, portanto, um maior rendimento pode ser obtido. Este método também permite o uso de tratamento inibidor localizada ao navio desejado enquanto intravital só permite o tratamento sistêmico inibidor.
Este é um método modificado para estudar a adesão de leucócitos ao endotélio intacto em vasos sanguíneos isolados, em condições pressurizadas em tempo real. Perfusão da câmara de navio só permite uma validação rápida de pró-inflamatórias linhagens de camundongos e grandes vasos de ratos. Manipulação de pressão permitindo que permite interações célula dinâmica a ser observado a partir de baixo a muito altas pressões intraluminais, assim, melhor imitar-ing fisiológicos e condições fisiopatológicas. Diâmetro dos vasos também pode ser medida usando um programa de imagens de células-suficiente e, portanto, o fluxo de cisalhamento e velocidade pode ser determinada e, portanto, manipulados.
Com as suas capacidades de myograph, intervenções farmacológicas colocado no banho acrescentar uma outra dimensão para as condições experimentais possível com esse modelo permite estudos de vias mecanicista e sinalização. Enquanto preservação endotelial não pode ser confirmado durante a manipulação de pressão, as respostas a ACh e PE podem ser conduzidas de perfusão pós 9.
Deve-se notar que essa configuração demonstra os efeitos da pressão intraluminal em célula a célula não interações dos efeitos do fluxo sangüíneo pulsátil nem sistólica ou diastólica. Além disso, enquanto as alterações de pressão aguda sobre a adesão de leucócitos foram observados, esta configuração pode ser também utilizada para analisar os efeitos da pressão crônica (ou seja, aumentando os tempos de incubação e utilizando um modelo animal crônica de pressão). Sprague Dawley artérias carótidas comuns são demonstradas neste conjunto para cima, mas outras linhagens e espécies podem ser usadas com ajustes apropriados para o tamanho da cânula. De fato, é importante notar que a idade eo peso dos animais afetam o tamanho do navio e, portanto, que a criação precisa ser individualizado para cada navio. Dissecção próxima e cuidadosa do tecido conjuntivo pode melhorar a visualização de leucócitos imensamente.
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi financiado em parte pelo Programa do Governo vitoriana do OIS, o National Health and Medical Research Council de bolsas da Austrália de programas e projetos (JPF Chin-Dusting) e bolsa de pós-graduação (D Michell).
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
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Microscope | Carl Zeiss, Inc | SteREO Discovery V.20 | |
PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
Digital Camera and Controller | Hamamatsu ORCA-ER | C4742-95 | |
Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS – 200 | |
Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM – 4 | |
2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT – F | |
Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |