Summary
Bu hasat basınçlı kaplar endotele lökosit yapışma görselleştirmek için bir yöntemdir. Bu teknik, bu nedenle yüksek kan basıncı fizyopatolojik koşullardaki taklit-200 mmHg intralüminal basınca kadar farklı kayma akışı altında vasküler yapışma eğitimi sağlar.
Abstract
Dünya çapında, hipertansiyon, nüfusun yaklaşık dörtte biri olması için bildirilen ve mortalite dünya çapında önde gelen biyomedikal risk faktörü. Vasküler hipertansiyon, endotel disfonksiyonu ve ateroskleroz ve 2 kronik böbrek hastalığı, felç 3 ve 4 kalp yetmezliği gibi çeşitli hastalık durumlarında önde gelen artış inflamasyon ile ilişkili . Bir ilk adım aterogenez yol açan vasküler inflamasyon, endotel ile yuvarlanma, bağlama, bağlılık ve lökositlerin sonraki göçüne içeren yapışma kaskad. İşe Alım ve lökositlerin endotele birikimi vasküler hücre adezyon molekülü-1 (VCAM-1), hücre içi hücre adezyon molekülü-1 (ICAM-1) ve E-selektin gibi artar gibi adezyon moleküllerinin bir upregülasyonu aracılı sitokin ve kemokin serbest bırakılması ve reaktif oksijen türlerinin bir upregülasyonu 5 in vitro yöntemleri gibi statik yapışma deneyleri, hücre-hücre adezyon yer mekanizmalarının yanı sıra hücre adezyon moleküllerinin analiz belirlemek için yardımcı olur . In vitro çalışmalar önceki istihdam Yöntemleri endotel üzerindeki akut basınç artar monosit adezyonu, adezyon molekülleri ve inflamatuvar belirteçler 6 Bununla birlikte, in vitro tayinlerde çok benzer, bu bulgular, gerçek zamanlı olarak yapılmış değil bir upregülasyonu yol açabileceğini göstermiştir fizyolojik akış koşulları altında, ne de tam kan. Bu nedenle, in vivo testleri giderek vasküler inflamasyon ve plak gelişimi göstermek için hayvan modellerinde kullanılmaktadır. Intravital mikroskopi artık yaygın lökosit adezyonu, haddeleme, göç ve göçüne 7-9 değerlendirmek için kullanılır. In vivo çalışmalar, endotelyal adezyon lökosit üzerinde basınç etkilerini birleştirerek daha geniş. Böyle bir çalışmada sadece 10 immünhistokimya ile değerlendirildi arteriyel büyüme ve remodeling ama inflamatuvar belirteçler kayma akışı ve gerçek zamanlı etkileri inceler. Burada bozulmamış basınçlı kan damarları tam kan perfüzyon kullanarak gerçek zamanlı lökosit adezyonu kayıt için bir model sunuyoruz. Metodolojisi, sağlam damarlarında lökosit-endotel yapıştırıcı etkileşimleri gerçek zamanlı analiz sağlayan bir ex vivo geminin kamara perfüzyon modeli 9 bir değişiklik . Bizim değişiklik intraluminal basınç 200 mmHg sadece fizyolojik akış koşulları değil, aynı zamanda basınç şartları altında çalışması için izin manipülasyon sağlar. Basıncı kasılmaların kâğıda çizilmesi sistemleri daha önce damar duvar ve lümen çapı 11 gibi damar daralma gözlemlemek için gösterilmiş olsa da bu gerçek zamanlı olarak lökosit leşimlerini gösteren ilk kez . Burada sıçanlardan alınan hasat ve floresan mikroskop birleştiğinde bir ölçüye göre akış odasına kanüle karotid arterler kullanılarak tekniği göstermektedir. Geminin kamara görüntü gemi kısa çalışma mesafesi ile geniş çaplı bir objektif lens sağlayan büyük bir alt coverglass ile donatılmıştır. Ayrıca, seçilen agonist ve / veya antagonistleri daha fazla hücre adezyon kontrol mekanizmalarının araştırılması için kullanılabilir. Intravital mikroskopi üzerinden bu yöntemin avantajları invaziv cerrahi hiçbir ilgisi ve bu nedenle daha yüksek bir verim elde edilebilir. Intravital sadece sistemik inhibitörü tedavisi sağlar iken Bu yöntem aynı zamanda istenen gemi lokalize inhibitörü tedavisi kullanımını mümkün kılar.
Protocol
1. Karotid arterlerin görme
- CO 2 / O 2 boğulma yoluyla Euthanase10 hafta eski Sprague Dawley rat.
- Gemilerin minimum esneme sağlamak Vergi aort ve kalp ile sağ ve sol karotis arterler.
- Buz Krebs tampon karotid arterler aorta ve kalp ayrı ve yakın diseksiyon.
- Monte etmeden önce buz üzerinde Krebs izole damarlarda tutun.
Yaklaşık. süresi = 45 dakika
2. Astar geminin kamara
- 37 tampon aracılığıyla ° C; carbogen gaz (% 5 CO 2% 95 O 2) beslerken fizyolojik pH muhafaza geminin kamara floş Krebs tampon proksimal ve distal konektörlerdeki
- Tüp olun ve kanüller tamamen kızardı ve hizalanır.
- Krebs tampon (proksimal) P1 ve P2 (distal) dönüştürücüler ile yıkayın. Dönüştürücüler içinde hava kabarcıkları sağlamak için Kapat musluklar.
- Dönüştürücüler gelen konektörlere bağlayın ve hiç hava kabarcığı sağlamak daha Krebs tampon tekrar yıkayın. Odaya musluğu açıp kapatın.
Yaklaşık. süresi = 15 dakika
3. Geminin kamara basınçlandırma
- Basınçlı ekipmanlar açın: basınç servo, basınç monitörü, peristaltik pompa (Şekil 1).
- Hiç hava kabarcığı sağlamak 20 mmHg (1 arama), tüp aracılığıyla otomatik çalıştırmak Krebs tampon baskı ve basınç servo peristaltik pompa ile.
- Kapalı P2 dönüştürücü boru bağlayın. Basınç kararlı hale gelecektir.
- Kabarcıkları sonra kapatabilir dışarı atılması için geminin odasına P2 musluğu açın.
- Krebs tamponu (5 - 7 ml) ile banyo doldurun.
Yaklaşık. süresi = 10 dakika
4. Montaj gemi
- Her kanül üzerine bir diseksiyon mikroskobu yer siyah polyester bağları (Şekil 2) altında.
- Kanüller ve kanül sahipleri dışında hareket ettirin ve montaj ¼ P1 kanül üzerine damar (aort kemer sonu). Geminin gözyaşı olun.
- Krebs tamponu ile dolu bir şırınga kullanarak yavaşça P1 transdüser aracılığı ile geminin aşırı kan dışarı floş. Odasına P1 kapatın.
- Polyester kravat P1 kanül Güvenli gemi.
- P2 kanül üzerine montaj için kanüller / yakın kanül sahipleri taşıyın.
- Mount gemi distal ucu (~ ¼ uzunluğu) distal kanül üzerine. Polyester kravat ile sabitleyin.
Yaklaşık. süresi = 20 dakika
5. Gemi basınçlandırma
- Geminin herhangi bir bükülme veya streç sağlamak için kanül sahipleri ayarlayın.
- P1 ve P2 odasının kapalı basınç servo manuel otomatik geçiş yapar. 10 saniye içinde basıncı sürekli bir azalma var basınç servo kontrol edin. Varsa, bir sızıntı meydana geliyor ve bağlantıları ve dönüştürücüler yerde güvenli olması gerekir.
- Geri basınç odasına otomatik olarak sonra açık P2 servo ayarlayın. Mikroskop altında odasına musluk açıldığında damar genişler gözlemliyoruz.
- Kılavuzuna basınç servo geçin. 10 saniye içinde basıncı sürekli bir düşüş için tekrar kontrol edin. Bir sızıntı varsa sonra sistem sıkı baskı ve geminin bir delik olması muhtemel değildir.
- Otomatik açık P1 odasına geri dönün. Manuel ayar basıncı sabit kalır olduğunu kontrol edin.
- Eğer herhangi bir sızıntı, manuel ayar artış kadran 2 (40 mmHg).
- Otomatik olarak ayarlayın ve mikroskop altında damar dikkat. Gerekirse, manuel ayar sızıntıları vessel.Check hiçbir bend sağlamak için kanül sahibinin ayarlayın.
- 5.7 istenen basınç ulaşana kadar 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) ve çevirmeli artan adımları 5.6 tekrarlayın.
Yaklaşık. süresi = 15 - 30 dakika
6. Basınçlı gemi kuluçka
- Sıcaklık kontrolörü seti - 37 ° C bağlayın
- Damar odasının banyo içine ikinci bir peristaltik pompa serpmek Krebs tampon (1 ml / dk).
- Banyo sadece üst katmanı sağlamak odasına aspiratör kaldırılır bağlayın.
- Basınçlı kap, otomatik olarak ayarlanan basınç ile 1 saat 37 ° C'de inkübe edin.
- Basıncı periyodik olarak (otomatik geçiş) sızıntı değildir kontrol edin.
- Sadece inkübasyon sırasında banyo bileşik ekleyerek çeşitli farmakolojik müdahalelerin etkileri görülebilir.
Yaklaşık. süresi = 1 saat
7. Basınçlı kap tam kan ile perfüze
- İnkübasyon sırasında en az 7.5 ml insan tam kan / 40 U heparin / ml kan toplanan gemi edinin. 50 ml şahin kuluçkaya 37 ° C.
- T 10 dakika önce37 ° de 10 dakika VybrantDil (1:1000) ile kuluçka etiket kan ° C karanlıkta.
- 10 dakika sonra, bir şırınga kabarcıkları temizleyerek, kan toplama ve 37 olarak belirlenmiş bir ısı ceketi ° C ile bir şırınga pompası üzerine eklemek
- P1 transdüser Kapatma odası / gemi ve şırınga ve atık tüp bağlayın.
- 1000 mcL / atık boru aracılığıyla herhangi bir kabarcıkları dakika Temizle kan.
- P1 odasına açın. Basınç servo istenen basıncı sağlamak için otomatik olarak ayarlanır.
- 100 mcL / dak kan serpmek.
- Bir dijital kamera kayıt 1 perfüze geminin 15 saniye boyunca iki alan, 3, 5, 7.5 ve 10 dakika birleştiğinde bir floresan mikroskop kullanarak.
- Perfüzyon endotel bütünlüğü ve fonksiyonu gibi inflamatuvar yanıtı daha doğrulamak için myograph ve adezyon molekülü ekspresyonu immünohistokimyasal olarak tespit edilebilir gibi farmakolojik teknikler ile tespit edilebilir.
Yaklaşık. süresi = 15 dakika
8. Temsilcisi Sonuçlar:
Basınç odasının kurulum şematik diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir. Floresan mikroskop sonuçları bir dijital kamera canlı video kayıtları üzerinden anında görüntülenebilmekte. Temsilcisi video görüntüleri lökosit 10 saniye boyunca sabit kaldı endotel yapışık olarak kabul edilir Şekil 3'te görülmektedir. Sürekli bir döngü yapıştırılır hücreleri üzerinde video kayıtları ile bir başına ortalama alanı olarak sayılabilir. , Hem de düşük (Şekil 3A) ve yüksek basınç (Şekil 3B) yapışma bir miktar neden olsa da yüksek intraluminal basınç lökosit adezyonu önemli bir artış görülür ve bu da kantitatif olarak gösterilmiştir (Şekil 4) .
Şekil 1. Basınçlı ex vivo geminin kamara şematik bir proksimal (P1), damar içinde manipüle kan basıncı sağlayan bir dönüştürücü ve distal (P2) dönüştürücüler bağlı kanüle bir gemi . Perfüzyon P1 dönüştürücü ve basınç yoluyla P2 transdüser ile korunur.
Şekil 2. Bağları olan Cannuala Siyah polyester bağları her kanül bağlıdırlar.
Şekil 3. Temsilci video görüntüleri 80 mmHg (A) ve 120 mmHg altında floresans Dinamik hücre adezyon (kırmızı ok) (B) perfüzyon 10 dakika sonra.
Şekil 4, 1 saat düşük inkübasyon (80 mmHg) ve yüksek basınç (120 mmHg) sonra Sprague Dawley Lökosit yapışma arterler karotid . *** P <0.001, Bonferroni post hoc testi kullanılarak 2-yönlü tekrarlayan ölçümler ANOVA ile analiz gibi.
Discussion
Bu, gerçek zamanlı olarak basınçlı koşullar altında bozulmadan izole kan damarlarının endotele lökosit adezyonu incelemek için modifiye edilmiş bir yöntemdir. Perfüzyon yalnız geminin odası, büyük fare ve sıçan damarları pro-inflamatuar suşlarının hızlı bir doğrulama sağlar. Etkinleştirilmesi basınç manipülasyon dinamik hücre etkileşimleri böylece daha iyi taklit-fizyolojik çok yüksek intraluminal basıncı ve fizyopatolojik koşullardaki düşük uyulması gereken sağlar. Damarların çapı da yeterli hücre görüntüleme programı kullanarak ve bu nedenle kayma akışı ve hızı belirlenir ve bu yüzden manipüle edilebilir ölçülebilir.
Kendi myograph yetenekleri ile, banyo yerleştirilir farmakolojik müdahaleler, mekanik ve sinyalizasyon yolaklar çalışmaları sağlayan bu model ile deneysel koşullar altında mümkün olan başka bir boyut ekleyin. Endotel korunması basınç manipülasyon sırasında teyit mümkün olmasa bile, ACh ve PE yanıtları yazılan perfüzyon 9 yapılabilir.
Bu kurulum hücre-hücre etkileşimleri pulsatil kan akımı, ne de sistolik ve diyastolik kan basıncı etkileri intraluminal basınç etkilerini göstermektedir dikkat edilmelidir. Ayrıca, lökosit adezyonu akut basınç değişiklikleri gözlenirken, bu kurulum da kronik basınç etkileri (yani artan inkübasyon sürelerinde ve kronik basınç hayvan modeli kullanarak) bakmak için kullanılan olabilir. Sprague Dawley karotis arterler bu set göstermiştir ama diğer suşları ve tür kanül boyutuna uygun düzenlemeler ile kullanılıyor olabilir. Gerçekten de, hayvanların yaş ve ağırlık seti kadar her gemi için bireyselleştirilmiş gerektiğini, böylece damar çapı etkiler ve dikkat etmek önemlidir. Bağ dokusu yakın ve dikkatli bir diseksiyon derece lökositlerin görselleştirme artırabilir.
Disclosures
Çalışma protokolü Alfred Tıbbi Araştırma ve Eğitim Precinct Hayvan Etik Kurulu ve Alfred Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı.
Acknowledgments
Bu çalışmada, Victoria Hükümeti OIS Programı, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya, program ve proje hibeleri (Toz-JPF Chin) ve yüksek lisans bursu (D Michell) tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Carl Zeiss, Inc. | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Digital Camera and Controller | Hamamatsu Corp. | C4742-95 | |
| Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS - 200 | |
| Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM - 4 | |
| 2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT - F | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |
References
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Szczech, L. A. Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension. Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.
- Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke. Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA. 275, 1557-1562 (1996).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Riou, S. High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall. Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).
- Ley, K., Gaehtgens, P. Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res. 69, 1034-1041 (1991).
- Bernhagen, J. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, 587-596 (2007).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Eberth, J. F. Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling. J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).
- Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator. J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).
