Dies ist eine Methode zur Leukozyten-Adhäsion an das Endothel in geerntet Druckbehälter zu visualisieren. Die Technik ermöglicht das Studium vaskulären Haftung unter Scherströmung mit unterschiedlichen intraluminale Drücke bis 200 mmHg damit nachahmen-Ing den pathophysiologischen Bedingungen des hohen Blutdrucks.
Worldwide, Bluthochdruck wird berichtet, dass in etwa ein Viertel der Bevölkerung und ist der führende biomedizinische Risikofaktor für die Mortalität weltweit. In den Gefäßen Hypertonie ist mit einer endothelialen Dysfunktion und erhöhte Entzündung führt zu Arteriosklerose und verschiedenen Krankheiten wie chronischen Nierenerkrankungen 2, 3 und Schlaganfall Herzinsuffizienz 4 zugeordnet. Ein erster Schritt in Gefäßentzündungen führt zu Arteriosklerose ist die Haftung Kaskade, die die Rollen, Anbindehaltung, die Einhaltung und anschließende Transmigration von Leukozyten durch das Endothel handelt. Rekrutierung und Akkumulation von Leukozyten an das Endothel wird durch eine Hochregulation von Adhäsionsmolekülen wie vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intrazelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) und E-Selektin sowie Erhöhungen in vermittelter Zytokin-und Chemokin-Freisetzung und eine Hochregulation von reaktiven Sauerstoff-Spezies 5. In-vitro-Methoden wie z. B. statische Haftung Assays helfen, die Mechanismen der Zell-Zell-Adhäsion beteiligt sowie die Analyse von Zell-Adhäsionsmoleküle zu bestimmen. Methoden in der früheren in vitro Studien verwendet haben gezeigt, dass akute Erhöhungen der Druck auf das Endothel kann Monozytenadhäsion, eine Hochregulation von Adhäsionsmolekülen und Entzündungsmarker 6 hingegen, ähnlich wie bei vielen in-vitro-Assays, diese Erkenntnisse noch nicht in Echtzeit durchgeführt führen unter physiologischen Strömungsverhältnisse, noch mit Vollblut. Daher sind in-vivo-Untersuchungen zunehmend in Tiermodellen genutzt werden, um vaskuläre Entzündungen und die Bildung von Zahnbelag zu demonstrieren. Intravital Mikroskopie ist mittlerweile weit verbreitet, um Leukozytenadhäsion, Walzgut, Migration und Transmigration 7-9 zu bewerten. Bei der Kombination der Auswirkungen von Druck auf die Leukozyten an endotheliale Adhäsion der in-vivo-Studien sind weniger umfangreich. Eine solche Studie untersucht die Echtzeit-Effekte von Strömungs-und Scherung auf arterielle Wachstum und Umbau, sondern Entzündungsmarker waren nur über Immunhistochemie 10 beurteilt. Hier präsentieren wir ein Modell für die Aufnahme Leukozytenadhäsion in Echtzeit in intakten Druck Blutgefäße mit Vollblut Perfusion. Die Methodik ist eine Modifikation eines Ex-vivo-Perfusion Schiff Kammer-Modell 9, die Echtzeit-Analyse von Leukozyten-Endothel-adhäsiven Wechselwirkungen in intakten Behältern ermöglicht. Unsere Modifikation ermöglicht die Manipulation der intraluminale Druck bis 200 mmHg Berücksichtigung Studie nicht nur unter physiologischen Strömungsverhältnisse, sondern auch Druckbedingungen. Während der Druck Myographie Systeme zuvor unter Beweis gestellt haben, um Gefäßwand und Lumen Durchmesser 11 sowie Gefäß Kontraktion zu beobachten ist dies das erste Mal zeigen, Leukozyten-Endothel-Interaktionen in Echtzeit. Hier zeigen wir die Technik mit Halsschlagadern von Ratten entnommen und Kanüle eingeführt, um eine maßgeschneiderte Flusskammer gekoppelt mit einem Fluoreszenzmikroskop. Das Schiff Kammer ist mit einem großen unteren Deckglas so einem großen Durchmesser Objektiv mit kurzer Arbeitsabstand zum Bild des Schiffes ausgestattet. Darüber hinaus können ausgewählte Agonisten und / oder Antagonisten eingesetzt zur weiteren Untersuchung der Mechanismen, die Zelladhäsion werden. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber Intravitalmikroskopie sind keine Beteiligung von invasiven Chirurgie und somit ein höherer Durchsatz erreicht werden kann. Diese Methode ermöglicht auch die Verwendung von lokalisierten Inhibitor Behandlung, um die gewünschte Gefäß während intravital nur ermöglicht systemische Inhibitor Behandlung.
Dies ist eine modifizierte Methode zur Leukozyten-Adhäsion an das Endothel in intakten isolierten Blutgefäßen unter Druckbedingungen in Echtzeit zu studieren. Perfusion des Schiffes Kammer allein ermöglicht eine schnelle Validierung von pro-inflammatorischen Stämme von großen Mäusen und Ratten Schiffe. Aktivieren Druck Manipulation ermöglicht dynamische Zell-Interaktionen von niedrig bis sehr hoch intraluminalen Druck, damit eine bessere Mimik-Ing physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen eingehalten werden. Durchmesser der Gefäße können ebenfalls gemessen mit einer ausreichenden Zell-Imaging-Programm und damit Scherströmung und kann ermittelt werden und somit manipuliert werden.
Mit seiner Myographions Fähigkeiten, fügen pharmakologische Interventionen in das Bad gelegt weitere Dimension der experimentellen Bedingungen möglich mit diesem Modell ermöglicht Untersuchungen von mechanistischen und Signalwege. Während endothelial Erhaltung kann nicht während der Druck Manipulation bestätigt werden, können Reaktionen auf ACh und PE post Perfusion 9 geführt werden.
Anzumerken ist, dass dieses Setup die Auswirkungen der intraluminale Druck auf Zell-Zell-Interaktionen nicht die Auswirkungen des pulsierenden Blutflusses noch systolische oder diastolische Druck zeigt werden. Hinzu kommt, dass akute Druckänderungen auf Leukozytenadhäsion beobachtet wurden, kann dieses Setup auch genutzt werden, um bei chronischen Druck-Effekte (dh die Erhöhung Inkubationszeiten und mit einem chronischen Druck Tiermodell) zu suchen. Sprague Dawley Arteria carotis communis werden in dieser Einrichtung aber gezeigt, andere Stämme und Arten können mit entsprechenden Anpassungen an die Kanüle Größe verwendet werden. In der Tat ist es wichtig zu beachten, dass das Alter und Gewicht der Tiere Gefäßgröße beeinflussen und damit, dass die Einrichtung muss für jedes Schiff individuell angepasst werden. Close und sorgfältige Dissektion des Bindegewebes kann Visualisierung der Leukozyten immens verbessern.
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde zum Teil durch die Regierung von Victoria ist OIS Programm, das National Health and Medical Research Council of Australia Programm-und Projektmanagement Zuschüsse (JPF Chin-Dusting) und Postgraduate-Stipendium (D Michell) unterstützt.
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
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Microscope | Carl Zeiss, Inc | SteREO Discovery V.20 | |
PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
Digital Camera and Controller | Hamamatsu ORCA-ER | C4742-95 | |
Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS – 200 | |
Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM – 4 | |
2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT – F | |
Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |