Detta är en metod för att visualisera leukocyt vidhäftning till endotelet i skördade trycksatta kärl. Tekniken gör det möjligt att studera vaskulär vidhäftning under skjuvning flöde med olika intraluminal tryck upp till 200 mmHg därmed efterliknar-ning de patofysiologiska förhållanden av högt blodtryck.
Worldwide, hypertoni rapporteras vara i cirka en fjärdedel av befolkningen och är den ledande biomedicinska riskfaktor för mortalitet över hela världen. I kärlsystemet hypertoni är förenat med endoteldysfunktion och ökad inflammation som leder till åderförkalkning och olika sjukdomstillstånd som kronisk njursjukdom 2, stroke 3 och hjärtsvikt 4. Ett första steg i vaskulär inflammation som leder till aterogenes är vidhäftning kaskad som involverar den rullande, tjudra, följsamhet och efterföljande transmigration av leukocyter genom endotelet. Rekrytering och ansamling av leukocyter till endotelet förmedlas av en uppreglering av adhesionsmolekyler som vaskulär celladhesionsmolekyl-1 (VCAM-1), intracellulära celladhesionsmolekyl-1 (ICAM-1) och E-selektin samt ökning av cytokin och kemokinreceptorantagonist utsläpp och en uppreglering av reaktiva syreradikaler 5. In vitro-metoder såsom statisk vidhäftning analyser hjälpa till att fastställa mekanismer som är involverade i cell-till-cell vidhäftning samt analys av molekyler celladhesion. Metoder som används i tidigare in vitro-studier har visat att akut ökning av trycket på endotelet kan leda till monocyter vidhäftning, en uppreglering av adhesionsmolekyler och inflammatoriska markörer 6 dock, i likhet med många in vitro-tester har dessa fynd inte utförts i realtid under fysiologiska flödesförhållanden, eller med helblod. Därför är in vivo-analyser alltmer används i djurmodeller för att visa vaskulär inflammation och plack utveckling. Intravital mikroskopi är nu allmänt används för att bedöma leukocyt vidhäftning, rullande, migration och transmigration 7-9. Vid kombination av effekterna av trycket på leukocyter till endothelial vidhäftning in vivo studier är mindre omfattande. En sådan studie undersöker realtid effekterna av flödet och sax på arteriell tillväxt och remodellering, men inflammatoriska markörer var bara bedömas genom immunohistokemi 10. Här presenterar vi en modell för inspelning leukocyt vidhäftning i realtid i intakt trycksatta blodkärl med hjälp av helblod perfusion. Metoden är en modifiering av en ex vivo fartyg kammare perfusionen modell 9 som möjliggör realtids-analys av leukocyt-endotelceller lim interaktioner i intakt fartyg. Vår modifiering möjliggör manipulation av intraluminal tryck upp till 200 mmHg möjliggör studier inte bara under fysiologiska flöde men även tryckförhållanden. Medan trycket myography system har tidigare visat att observera kärlväggen och lumendiameter 11 samt fartyg kontraktion det är första gången visar leukocyt-endotel interaktioner i realtid. Här har vi demonstrera tekniken med hjälp av halspulsåder skördas från råttor och kanylerade till en skräddarsydd flöde kammare kopplad till ett fluorescerande mikroskop. Fartyget kammaren är utrustat med en stor botten coverglass gör en stor linsdiameter mål med kort arbetstid avstånd till bilden fartyget. Dessutom kan väljas agonist och / eller antagonister utnyttjas för att ytterligare undersöka de mekanismer som styr cellens vidhäftning. Fördelarna med denna metod under intravital mikroskopi inkluderar ingen inblandning av invasiv kirurgi och därmed en högre genomströmning kan erhållas. Metoden möjliggör också användningen av lokaliserad hämmare till önskad fartyget medan intravital bara möjligt för systemisk hämmare.
Detta är en modifierad metod för att studera leukocyt vidhäftning till endotelet i intakt isolerade blodkärl under trycksatta förhållanden i realtid. Perfusion av fartyget kammaren ensam möjliggör en snabb validering av pro-inflammatoriska stammar av stora möss och fartyg råtta. Aktivera tryck manipulation ger dynamiska cell interaktioner skall beaktas från låg till mycket hög intraluminal tryck och därmed bättre efterliknar-ning fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Diameter av fartyg kan också mätas med hjälp av en tillräckligt cell-imaging program och därför skjuv flöde och hastighet kan bestämmas och därmed manipuleras.
Med sin myograph kapacitet, farmakologiska interventioner placeras i badet lägga till ytterligare en dimension till de experimentella förutsättningar som möjligt med denna modell möjliggör studier av mekaniska och signalsystem. Medan endotel bevarande inte kan bekräftas under tryck manipulation, kan svaren på ACh och PE ske efter perfusion 9.
Det bör noteras att denna inställning visar effekterna av intraluminal press på cell-till-cell interaktioner inte effekterna av pulserande blodflödet eller systoliskt eller diastoliskt tryck. Vidare, medan akuta tryckförändringar på leukocyt vidhäftning observerades, kan denna inställning också användas för att titta på kroniska tryck effekter (dvs. att öka inkubationstiderna och med hjälp av en kronisk modell trycket djur). Sprague Dawley gemensamma halspulsåder demonstreras i denna uppsättning upp men andra stammar och arter kan användas med lämpliga justeringar av kanylen storlek. Det är faktiskt viktigt att notera att ålder och djurens vikt påverkar fartygets storlek och därmed att ställa in måste individualiseras för varje fartyg. Stäng och noggrann dissekering av bindväv kan förbättra visualisering av leukocyter oerhört.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie har delvis stöd i den viktorianska regeringens OIS Program, National Health och Medical Research Council of Australia program och projektbidrag (JPF Chin-damma) och UTBILDNINGSBIDRAG (D Michell).
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Microscope | Carl Zeiss, Inc | SteREO Discovery V.20 | |
PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
Digital Camera and Controller | Hamamatsu ORCA-ER | C4742-95 | |
Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS – 200 | |
Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM – 4 | |
2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT – F | |
Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |