चूहों में, pheromones का पता लगाने की क्षमता मुख्य vomeronasal अंग (VNO) द्वारा मध्यस्थता है. यहाँ, कैल्शियम इमेजिंग प्रदर्शन के लिए एक तीव्र ऊतक VNO का टुकड़ा तैयारी में वर्णित है. यह शारीरिक दृष्टिकोण एक ऊतक रहने में subpopulations और / या व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की टिप्पणियों की अनुमति देता है और रिसेप्टर ligand की पहचान के लिए सुविधाजनक है.
Peter Karlson and Martin Lüscher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.
कैल्शियम इमेजिंग विधि यहाँ प्रस्तुत करने के लिए एक गंभीर टुकड़ा तैयारी में रिकॉर्ड, माउस VNO न्यूरॉन्स की pheromonal प्रतिक्रिया करने के लिए सक्षम बनाता है. इस दृष्टिकोण के साथ, जानवर से vomeronasal न्यूरॉन्स को विच्छेदन कुछ अभ्यास के साथ है, आसानी से प्राप्त है और लंबे समय से रहने वाले एक ऊतक तैयारी प्रदान करता है. यह औषधीय जांच या pheromonal कोडिंग के अध्ययन की तरह समय लेने वाली प्रयोगों की अनुमति देता है. इस शारीरिक तकनीक के साथ, बड़ी आबादी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सटीक neuronal subpopulations विशेष रूप से विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अलावा, इस विधि को आसानी से immunohistochemical दृष्टिकोण या अन्य कैल्शियम रंगों पर आधारित प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इन संयुक्त तरीके का उपयोग निश्चित रूप से कई अनाथ माउस vomeronasal अंग में व्यक्त chemoreceptors के लिए नए pheromonal ligands की पहचान की अनुमति देगा.
The authors have nothing to disclose.
हम उनकी वैज्ञानिक सलाह और इमेजिंग सीआईएफ मंच खुर्दबीन उपकरणों के लिए UNIL के लिए विशेष रूप से उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Monique Nenniger Tosato के रूप में अच्छी तरह के रूप में जीन Yves Chatton शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. अनुदान स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा प्रदान की गई थी.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck | 317275-100ML | |
Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth | 0258.1 | |
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |