Summary
Chez la souris, la capacité à détecter des phéromones est principalement médiée par l'organe voméronasal (VNO). Ici, une préparation tissulaire aiguë tranche de VNO pour effectuer l'imagerie calcique est décrite. Cette approche permet des observations physiologiques des sous-populations et / ou des neurones individuels dans un tissu vivant et est commode pour récepteur-ligand d'identification.
Abstract
Peter Karlson et Martin Lüscher utilisé la phéromone terme pour la première fois en 1959 pour décrire une chimiques utilisés pour la communication intra-espèces. Les phéromones sont volatiles ou non volatiles courte durée molécules sécrétées 2 et / ou contenus dans les fluides biologiques 3,4, tels que l'urine est un liquide connu pour être une des principales sources de phéromones 3. La communication phéromonale est impliqué dans une variété de modalités d'animaux tels que les interactions clés kin 5,6, 3 et les organisations hiérarchiques interactions sexuelles 7,8 et sont par conséquent directement corrélée avec la survie d'une espèce donnée 9,10,11. Chez la souris, la capacité à détecter des phéromones est principalement médiée par l'organe voméronasal (VNO) 10,12, une structure paire située à la base de la cavité nasale, et enfermé dans une capsule cartilagineuse. Chaque VNO a une forme tubulaire avec un lumen 13,14 permettant le contact avec les vérificateurs externesmonde chimique. Le neuroépithélium sensorielle est principalement composé de neurones bipolaires voméronasal sensorielles (VSN) 15. Chaque VSN s'étend une dendrite unique pour la lumière se terminant en une poignée de grandes dendritiques portant jusqu'à 100 microvillosités impliquées dans la détection chimique 16. Sous-populations de nombreux VSN sont présents. Ils sont différenciés par la chémorécepteurs qu'ils expriment et donc éventuellement par le ligand (s) qu'ils reconnaissent 17,18. Deux principales familles de récepteurs voméronasal, V1Rs et V2Rs 19,20,21,22, sont composés respectivement de 240 et 120 23 24 membres et sont exprimés dans des couches distinctes du neuroépithélium. Les récepteurs olfactifs (OR) 25 et les récepteurs de peptides formyl (FPRs) 26,27 sont également exprimés en VSN.
Que ce soit ou non ces sous-populations neuronales utiliser la même voie de signalisation en aval des phéromones de détection est inconnue. Malgré un rôle majeur joué par un calcium-perméable canal (TRPC2) présents dans les microvillosités des neurones matures 28 TRPC2 canaux de transduction indépendante ont été suggérées 6,29. En raison du nombre élevé de sous-populations neuronales et la morphologie particulière de l'orgue, les enquêtes pharmacologiques et physiologiques des éléments de signalisation présentes dans le VNO sont complexes.
Ici, nous présentons une préparation tissulaire aiguë tranche de la VNO la souris pour effectuer des examens d'imagerie calcique. Cette approche physiologique permet des observations, dans le milieu naturel d'un tissu vivant, des sous-populations générale ou individuelle du VSN préalablement chargé avec Fura-deux heures, un colorant de calcium. Cette méthode est également commode pour étudier tout récepteur GFP-tagged phéromone et est adaptable pour l'utilisation d'autres sondes fluorescentes de calcium. Comme exemple, nous utilisons ici une souris VG ligne 30, dans laquelle la traduction du récepteur de phéromones V1rb2 est liée à l'expression de la GFP par une stratégie polycistronique.
Protocol
1. Dissection de la souris VNO
- Utilisez la souris adulte. Comme phéromone de détection est impliqué dans multimodalities, distinguer soigneusement entre les souches, les génotypes, les sexes et les âges est importante et va influencer vos résultats. Ici, nous choisissons souris adultes VG 30 précédemment utilisés pour l'identification d'une paire phéromone-récepteur (2-heptanone-V1rb2) 31 (fig. 1A).
- Avant de commencer la dissection, préparer douce froide artificielle liquide céphalo-rachidien (ACSF; NaCl 118 mM, NaHCO 3 25 mM, D-glucose 10 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1,2 mM, CaCl 2 2 mM, pH 7,4) saturé avec oxycarbon (95% d'O 2: 5% de CO 2). Pour cela, mélanger tous les composants, sauf ACSF CaCl 2. Saturer la solution par barbotage directement avec oxycarbon. À la fin, ajouter le CaCl 2 et d'ajuster avec ddH 2 0 au volume désiré. Conserver la solution ACSF sur la glace jusqu'à ce que uSE.
- L'euthanasie de la souris doit être préférentiellement réalisée par dislocation cervicale ou par inhalation de CO 2, juste avant l'expérience.
- Couper la tête de la souris. Placez-le sous un microscope à dissection au froid en permanence oxycarbonated ACSF.
- Couper la mâchoire inférieure et la position de la tête afin de visualiser le palais (Fig. 1B).
- Faire une incision horizontale dans la partie supérieure du palais (Fig. 1B) avec des ciseaux micro et retirer la membrane en bouche avec micro pince à disséquer. Hydrater et nettoyer la cavité exposée avec ACSF (Fig. 1C).
- Couper la partie supérieure et la partie inférieure de la cloison nasale (Fig. 1C). Délicatement extraire la cloison nasale contenant le VNO et le placer directement dans l'ACSF sur la glace (Fig. 1D).
- Séparés verticalement les deux parties du VNO à l'aide de micro pince à disséquer et délicatement retirer la capsule cartilagineuse du VNO (Fig. 1E). Assurez-vous que toutes les pièces cartilagineuses sont supprimés.
2. Préparation VNO coupe de tissu
La préparation VNO tranche de tissus décrits dans cette section 2) est principalement pour les enquêtes imagerie calcique. Tranches VNO peut aussi être utilisé pour immunohistostainings sur des tranches flottantes pour vérifier l'intégrité structurelle du tissu (s'il vous plaît voir la section 3) du Protocole).
- Préparer bas point de fusion de gélose (3% de la norme PBS) et votre lieu de travail. Vous aurez besoin de l'ACSF, un microtome et des supports, micro pince à disséquer, l'intégration de moules (22 x 22 x 20 mm), des lingettes de précision, des brosses, des plaques de culture tissulaire, cyanacrylat colle, glace et un thermomètre.
- Remplissez le moule intégration avec 3% d'agar bas point de fusion. Assurez-vous que la température n'est pas supérieure à 41 ° C avant de les placer verticalement la peu effacé VNO (figure 2A) pour être en mesure d'obtenir des tranches coronales.
- Placer le moule sur la glace intégrationpendant 1 min jusqu'à solidification et ensuite le séparer du bloc de gélose. Couper le bloc de gélose dans une forme pyramidale et placez-le avec de la colle sur le support microtome (figure 2B).
- Couper les tranches coronales VNO avec le microtome, avec une vitesse de 0,5 mm / s, une amplitude de 0,7 mm et une épaisseur de 100 um à froid ACSF et de recueillir les tranches de tissu avec un pinceau avant de les placer dans une assiette remplie de culture de tissus par le froid ACSF.
- Si vos tranches contiennent de fluorescence endogène comme la GFP (en génique ciblée les neurones), vous pouvez les sélectionner sous un stéréomicroscope fluorescentes (figure 2C).
3. Immunohistochimie sur coupes flottantes VNO
Le but de cette procédure est de vérifier l'intégrité des tranches de tissu VNO obtenus dans la section 2). Acétylé-tubuline est un marqueur de microtubules / cytosquelette exprimées dans les dendrites et les microvillosités des neurones sensoriels VNO. Pour des expériences d'imagerie calcique, allez directionTLY à la section 4) du Protocole. La méthode immunohistostaining sur des tranches flottantes VNO peuvent être adaptés à l'évaluation de l'expression d'une protéine d'intérêt. À cette fin, nous vous recommandons de fixer le VNO pour 1h à 4 ° C dans une solution de fixation (paraformaldéhyde à 4% dans du PBS, pH 7,6) après le point 1.7) du protocole et de l'utilisation de cette PBS à pH 7,6 points plutôt que solution de l'ACSF.
- Dans la plaque de culture tissulaire, fixer vos tranches d'intérêt dans une solution de fixation (paraformaldéhyde à 4% dans du PBS, pH 7,6) 1h à 4 ° C.
- Bloc vos tranches de tissu une nuit à 4 ° C dans une solution de PBS contenant END (sérum normal de chèvre) 10% et le Triton X-100 à 0,5%.
- Incuber tranches avec l'anticorps primaire (anticorps anti-tubuline acétylée, souris, 1:2000) pendant 16 heures à température ambiante (TA) dans une solution de PBS contenant 5% de NGS et de Triton X-100 à 0,25%.
- Lavez 3 fois pendant 5 minutes avec une solution de PBS contenant 2% de NGS.
- Incuber dans l'obscurité avec le secoNdary anticorps (Cy5 conjugués de chèvre anti-souris, 1:200) dans une solution de PBS contenant 2% de NGS pour 1h à température ambiante.
- Lavez 3 fois pendant 5 minutes avec du PBS contenant 2% de NGS, PBS END 1% et PBS.
- Mont vos tranches dans un média fluorescents montage (contenant ou non DAPI) en les plaçant au centre des zones délimitées hydrophobe (utiliser un stylo hydrophobe) et couvrir les tranches avec des lamelles.
- Faire des observations et des acquisitions avec la microscopie confocale et un logiciel permettant des reconstructions 3D (Fig. 2D-F).
4. Imagerie calcique sur des tranches de VNO
- Les procédures suivantes auront lieu dans l'obscurité. Incuber tranches VNO pour 1h à 37 ° C dans une solution de chargement composé de froid ACSF avec Fura-deux heures (7 uM; solution stock de 1 mM dans le DMSO) et pluronic 0,1% (p / v; solution stock à 20% dans le trou DDH 2 O).
- Gardez les tranches chargé sur la glace avec oxycarbonation jusqu'à utilisation. Loaded tranches peuvent être conservés pour3-4h.
- Placer les tranches de chargement avec une brosse dans une chambre de perfusion contenant ACSF et de maintenir les tranches avec une ancre coupe de tissu (figure 3A).
- Placer la chambre de perfusion sur la scène d'un microscope à l'imagerie calcique (Fig. 3B) et en continu perfuser avec oxycarbonated ACSF à RT. La température peut être adaptée à l'utilisation d'un régulateur de température bipolaire.
- Observations des tranches de VNO chargé (Fig. 3C-E) sont réalisées avec un microscope inversé à fluorescence, avec un objectif 25x ou 63x et un CooL SNAP-HQ caméra. L'éclairage est fait de manière séquentielle (340/380 nm) avec un instrument polychromateur et enregistrés à une fréquence de 5Hz. D'émission filtrée est fait à 510 nm. Intracellulaire de calcium changements de rapport (AF = 340 nm/380 nm) sont surveillés par un logiciel approprié.
- Chemostimulation doit être choisi en fonction de vos propres fins expérimentales. Ici, des perfusions de ACSF contenant une phéromone mix (isobutylamine, la 2-heptanone, 4-heptanone, 2-heptanol, pentylacetate, diméthylpyrazine, α / β-farnésène, 10 -6 M), 2-heptanone (10 -6 M) ou fraîchement récoltés mâle et femelle (1: 1) l'urine de souris (1:100) sont effectuées 32. Perfusion d'ATP (125 uM) est utilisé comme un test de viabilité à la fin de l'expérimentation (Fig. 3F) et devraient indiquer une proportion d'environ 80% des neurones viables. Dans ces conditions, les tranches peuvent être utilisés jusqu'à 2 heures.
- Sous-populations GFP-tagged de neurones sensoriels sont visualisés par illumination spécifique (ici, les neurones exprimant V1rb2) et peuvent être analysées avec précision (Fig. 3G-I).
5. Les résultats représentatifs:
Pour établir un dosage fonctionnel pour enquêter sur la transduction du multi voies en prenant place dans le VNO souris, ou d'identifier de nouvelles phéromones récepteurs paires, nous profitons de la ligne VG de la souris (fig. 1A (figure 1E), nous préparons aiguë tranches VNO (figure 2C). Nous fixons une fraction d'entre eux, afin de vérifier et de valider l'intégrité tissulaire de la préparation en effectuant immunohistostainings contre la protéine acétylée-tubuline (Fig. 2D-F). L'autre fraction des tranches est utilisé pour des expériences d'imagerie calcique. Pour cela, les tranches sont chargés avec Fura-2 heures (Fig. 3C-E) et le niveau de calcium intracellulaire de chaque neurone est surveillé comme un ratio AF (figure 3F). Viabilité des neurones est évaluée par la perfusion d'ATP (125 uM), après quoi augmentation rapide et transitoire du ratio AF est attendu (figure 3F). L'urine étant une source importante de phéromones, la perfusion de produits fraisl'urine de souris Ly collectées (1:100) est utilisé comme un contrôle endogène. Il déclenche transitoires calciques dans environ 50% des neurones enregistrés (cellules 1 et 2, Fig. 3F). Sous un éclairage GFP, V1Rb2 neurones positifs sont observables, et la perfusion de son ligand phéromonal connue, la 2-heptanone, initie l'activation cellulaire (cellule 1, Fig. 3I). Fait intéressant, les activations neuronales sont également observables en une fraction de neurones qui n'expriment pas le récepteur V1Rb2 (neurones GFP négatifs) (cellule 2, fig. 3I), démontrant la complexité de la phéromone de codage dans le VNO.
Figure 1. Dissection de l'organe voméronasal de la souris. (A) Une souris à partir de la ligne VG. (B) Après l'euthanasie de la souris, la tête pleine est placé sous un microscope binoculaire et la mâchoire inférieure est enlevée afin de visualiser le palais. Une petite incision horizontale est faite(Ligne noire en pointillés). (C) Après l'enlèvement du voile du palais, la cloison nasale alignés avec le VNO est coupé dans la partie supérieure et la partie inférieure (blanc pointillé) pour faciliter l'extraction VNO. (D) Le VNO est positionné dans une solution de l'ACSF et séparés (insérer: Vue de puissance plus élevé des deux parties). (E) La capsule cartilagineuse du VNO est délicatement retiré, et le VNO sans capsule cartilagineuse est utilisé pour le reste de l'expérimentation. Barres d'échelle sont les suivants: BE, 1 mm.
Figure 2. Souris voméronasal préparation de tranches aiguës et de l'intégrité tissulaire. (A) Le VNO est verticalement intégré la souris dans une solution d'agar à 3%. La température de la gélose doit être inférieure à 41 ° C. (B) Le bloc d'agar est coupé en une forme pyramidale et 100 um sections VNO (ligne noire en pointillés) sont générés dans l'ACSF. (C) tranches VNO peut être sélectionné sous un stéréomicroscope fluorescentes afin de visualiser un particulierpopulation de neurones sensoriels marqués. (DF) de l'intégrité tissulaire peut être évalué par immunohistostainings contre la protéine acétylée-tubuline, une vue plus grande puissance de l'V1rb2 génique ciblée les neurones de démontrer la parfaite conservation de la préparation. Neurones avec leurs dendrites longues atteignant la surface de la lumière (E) ainsi que l'expression de la protéine structurelle des boutons dendritiques et microvillosités peuvent être observées (F). Barres d'échelle sont les suivantes: B, 5 mm; C, 60 um; D, 40 um; EF, 20 um.
Imagerie calcique Figure 3. Et la détection des phéromones dans les tranches de tissu voméronasal aiguë. (A) Après un Fura-2 heures phase de chargement, des tranches de VNO sont placés dans une chambre de perfusion et sont maintenues avec une ancre adaptée (vue de forte puissance). (B) des expériences sont effectuées dans les tranches sombre et VNO sont continuellement perfusées avec ACSF à TA avec un système de vide. La température peut être chosfr en utilisant un système de régulateur de température composé d'un élément bipolaire Pelletier et une sonde thermique. Cette expérience particulière a été réalisée à température ambiante. (CE) tranches VNO sont observables sous contraste de phase Hoffman (C, HV) ou l'illumination Fura 380 nm avant (D) et lors de l'activation neuronale (E, ici avec l'ATP). (F) la viabilité neuronale est évalué avec une perfusion d'ATP (125 pM). Ici, chemostimulation est fait avec de l'urine (urine, 1:100) ou avec un mélange de phéromones de la souris (ph mix., 10 -6 M) à un débit constant de 165 ml / h. Les niveaux de calcium intracellulaire (AF) peuvent être enregistrées individuellement pour chaque cellule (cellule 1 à 3). (G) Un neurone V1Rb2 est visualisée sous un éclairage GFP (1). (H) Le chargement de ce neurone (1) ainsi que d'un neurone non V1rb2 exprimer (2) est montrée. (I) Le neurone est V1rb2 mesure de répondre à la 2-heptanone avec une augmentation du calcium intracellulaire. Ce particulier la non-V1rb2 neurone répond également à exprimer la 2-heptanone (cellule 2). Barres d'échelle sont: CE, 20 um; GH,15 um; AF = 340 nm / 380 nm. (F et I) Durée d'application de relance est indiquée par des barres sous chaque trace. L'échelle de couleurs arbitraires représente l'intensité de fluorescence.
Discussion
La méthode d'imagerie calcique présenté ici permet d'enregistrer, dans une préparation de tranches aiguës, les réponses des phéromones de neurones VNO souris. Avec cette approche, la dissection de l'animal à l'neurones voméronasal est, avec une certaine pratique, facilement réalisable et offre une préparation de tissu vivant longtemps. Il permet de temps des expériences comme les enquêtes pharmacologiques ou l'étude du codage phéromonal. Avec cette technique, physiologiques, des populations importantes ainsi que des sous-populations précises de neurones peut être analysée spécifiquement. En outre, cette méthode peut être facilement adapté à des approches immunohistochimiques ou des expériences à base de colorants de calcium. L'utilisation de ces méthodes combinées va sûrement permettre l'identification de nouveaux ligands pour les phéromones chémorécepteurs orpheline de nombreux exprimée dans l'organe voméronasal de la souris.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier particulièrement Monique Nenniger Tosato pour son excellent support technique ainsi que Jean-Yves Chatton pour ses conseils scientifiques et la plate-forme d'imagerie CIF de l'UNIL pour l'équipement de microscope. Le financement a été fourni par le Fonds national suisse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
| Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
| CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
| Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck & Co., Inc. | 317275-100ML | |
| Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
| Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
| FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
| Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
| Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
| MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
| Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
| Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
| Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
| Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
| Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth GmbH | 0258.1 | |
| SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
| Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
| Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
| Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
| Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
| VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
| 3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |
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