Summary
マウスでは、フェロモンを検出する能力は、主に鋤鼻器官（VNO）によって媒介される。ここでは、カルシウムイメージングを行うためのVNOの急性組織のスライス標本が記載されている。この生理学的アプローチは、生体組織に集団および/または個々の神経細胞の観察を可能にし、受容体 - リガンドの識別に便利です。
Abstract
ピーターカールソンとマーティンルッシャーは、イントラ種の通信に使用される化学物質を記述するために1959年1で初めて長期的フェロモンを使用していました。フェロモンは揮発性または不揮発性の短命な分子である2分泌および/ または尿など、フェロモン3の主な源であることが知られている液体のような生物学的流体3,4、に含まれている。フェロモンコミュニケーションは、親族間相互作用5,6、階層的な組織3、性的な相互作用7.8などの主要な動物のモダリティの多様に関与していると結果的に直接与えられた種9,10,11の生存と相関している。マウスでは、フェロモンを検出する能力は、主に鋤鼻器官（VNO）10,12、鼻腔の底部にある対になった構造によって媒介される、と軟骨カプセルに封入。各VNOは、外部との接触を可能にする内腔13,14と筒形状を有している化学の世界。感覚神経上皮は、主に鋤鼻バイポーラ感覚ニューロン（VSNを）15で構成されています。各VSNは、化学物質の検出16に関与する100絨毛まで付いた大きな樹のノブで終わる腔に単一の樹状突起を拡張します。 VSNの多数の亜集団が存在している。それらはおそらく彼らが17,18を認識するリガンド（s）でこのように表現し、化学受容器によって区別されます。二つの主要な鋤鼻受容体ファミリー、V1RsとV2Rs 19,20,21,22は 、240 23 120 24メンバーによってそれぞれ構成され、神経上皮の別々の層で表されます。嗅覚受容体（ORS）25とホルミルペプチド受容体（FPRの）26,27は、VSNをで表されます。
これらのニューロンの亜集団は、センシングフェロモンのために同じ下流のシグナル伝達経路を使用しているかどうかは不明です。カルシウム透過性チャネル（が果たす主要な役割にもかかわらず28 TRPC2独立した情報伝達のチャンネルが6,29を提案されている成熟した神経細胞の微絨毛に存在TRPC2）。神経細胞集団の数が多いとオルガンの独特な形態のために、VNOに存在するシグナル伝達要素の薬理学的および生理学的な調査は複雑です。
ここで、我々は、カルシウムイメージングの調査を行うためのマウスVNOの急性組織のスライス標本を提示する。この生理学的アプローチは、以前にフラ- 2AM、カルシウム色素でロードされたVSNの一般的なまたは個々の部分集団の生体組織の自然環境、で、観察することができます。このメソッドは、GFPタグ付きのフェロモン受容体を研究するにも便利ですし、他の蛍光カルシウムプローブの使用のための適応です。例として、我々はここにフェロモンV1rb2受容体の翻訳はポリシストロン戦略によるGFPの発現にリンクされているVGマウス30行目を 、使用してください。
Protocol
1。マウスVNOの解剖
- 成体マウスを使用してください。フェロモンセンシングがmultimodalitiesに関与しているように、菌株、遺伝子型、性別と年齢の間に慎重に区別は重要であり、あなたの結果に影響を与えます。ここで、我々は以前にフェロモン受容体ペア（2 -ヘプタノン- V1rb2）31（ 図1A）の識別に使用される成人VGマウス30を選択します。
- 塩化ナトリウム118 mMの、飽和NaHCO 3 25mMの、D -グルコース10 mMのは、KCl 2mMの、のMgCl 2 2mMの、のNaH 2 PO 4 1.2 mMの、CaCl 2の 2、解剖を開始する前に、新鮮な寒さの人工脳脊髄液を（ACSF準備mMの、oxycarbon（95％O 2で飽和pHは7.4）：5％CO 2）。そのためには、CaCl 2の場合を除き、すべてのACSFのコンポーネントを混在させること。直接oxycarbonでそれをバブリングすることにより解決策を飽和させる。最後に、CaCl 2を追加し、必要な量にのddH 2 0で調整してください。 Uまで氷上でACSFのソリューションを維持するSE。
- マウスの安楽死は、優先的にただの実験の前に頚椎脱臼によりまたはCO 2吸入により行われる必要があります。
- マウスの頭部をカット。継続的にoxycarbonated冷たいACSFで解剖顕微鏡の下に置きます。
- （ 図1B）口蓋を視覚化するために下顎との位置頭をカット。
- マイクロはさみによる口蓋の上部（ 図1B）に水平に切開を行い、ミクロ解剖ピンセットで口蓋の膜を取り除く。水和物とACSF（ 図1C）で公開された空洞をきれいに。
- 上部を切り取り、鼻中隔（ 図1C）の下部。微妙にVNOを含む鼻中隔を抽出し、氷（ 図1D）にACSFに収めます。
- 垂直にマイクロ解剖鉗子を使用してVNOの二つの部分を分離し、繊細なVNOの軟骨カプセルを削除（図。 1E）。すべての軟骨の部分が削除されていることを確認します。
2。 VNOの組織のスライス標本
このセクション2）で説明されているVNO組織のスライス標本では、主にカルシウムイメージングの調査のためです。 VNOのスライスは、組織の構造的完全性をプロトコルの（セクション3を参照してください））を確認するためにフローティングされたスライス上のimmunohistostainingsに使用することができます。
- 低融点寒天（標準PBS中の3％）と作業場所を準備します。あなたは、精度のワイプ、ブラシ、組織培養プレート、cyanacrylat接着剤、氷と温度計をACSF、ミクロトームとサポートし、マイクロ切開鉗子、埋め込み型（22 × 22 × 20 mm）を必要になります。
- 3パーセントの低融点寒天で埋め込み金型を埋める。温度が41よりも高いではないことを° C冠状スライスを得ることができるように垂直にすぐに一掃VNO（ 図2A）を配置する前に確認してください。
- 氷の上で埋め込み金型を配置その後1凝固までの分とのために寒天のブロックからそれを分離する。ピラミッド型の形状で寒天ブロックをカットし、ミクロトームサポート（ 図2B）に接着剤でそれを置きます。
- 0.5ミリメートル/秒、0.7 mmの振幅と冷たいACSFで100μmの厚さの速度で、ミクロトームで冠状VNOスライスをカットし、寒さで満たされた組織培養プレートに置く前に、ブラシで組織切片を収集するACSF。
- あなたのスライスがGFPのような内因性の蛍光を（遺伝子標的ニューロンの）が含まれている場合には、蛍光実体顕微鏡（ 図2C）の下でそれらを選択することができます。
3。 VNO浮動スライス上で免疫組織化学
この手順の目的は、セクション2）で得られたVNOの組織切片の整合性を確認することです。アセチル化チューブリンは、VNO感覚ニューロンの樹状突起と微絨毛に発現し微小管/細胞骨格マーカーです。カルシウムイメージング実験のために、方向を行くtlyへのプロトコルのセクション4）。フローティングVNOスライス上で免疫組織染色法は、対象とする任意のタンパク質の発現の評価に適応することができます。この目的のために、我々は、4℃で1時間のためにVNOをする、解決することを° Cを固定液で（PBS、pHが7.6のパラホルムアルデヒド4％）ポイント1.7の後に）この時点PBSからプロトコルと使用のpHは7.6ではなく、お勧めACSFソリューション。
- 組織培養プレートでは、固定液に興味のあるスライス（PBS、pHが7.6のパラホルムアルデヒド4％）で4 1H℃を修正
- 0.5％でNGS（血清正常ヤギ）10％、トリトンX - 100を含むPBS溶液で4℃一晩あなたの組織切片° Cをブロックする。
- 0.25パーセントでNGS 5％トリトンX - 100を含むPBS溶液で室温（RT）で16時間一次抗体とスライス（抗アセチル化チューブリン、マウス、1:2000）インキュベートする。
- NGS 2％を含むPBS溶液で5分間3回洗浄する。
- セコで暗所でインキュベートNGSの室温で1時間の2％を含むPBS溶液でndary抗体（Cy5標識ヤギ抗マウス、1:200）。
- のみNGSの2％、PBS NGS 1％を含むPBSとPBSで5分間3回洗浄する。
- 疎水性の区切りゾーン（疎水性のペンを使用する）の中央に配置することにより、蛍光マウンティング培地（DAPIを含むかどうか）でスライスをマウントし、カバースリップを持つスライスをカバー。
- 共焦点顕微鏡と3D再構成（ 図2D - F）を許可するソフトウェアを使用して観測し、買収を行う。
4。 VNOのスライス上にカルシウムイメージング
- 次の手順では、暗闇の中で行われます。 37 1時間インキュベートVNOスライス°フラ- 2AM（7μM、DMSO中の1mMのストック溶液）で冷たいACSFで構成されるローディング溶液中でCとプルロニック0.1％（w / vの;のddH 2で20％のストック溶液O）。
- 使用するまでoxycarbonationと氷の上にロードされたスライスをしてください。ロードされたスライスを使用するために残しておくことができます3 - 4H。
- ACSFを含む灌流チャンバー内のブラシでロードされたスライスを置き、組織切片のアンカー（ 図3A）とスライスを維持する。
- カルシウムイメージング顕微鏡（ 図3B）のステージ上の灌流チャンバーを置き、継続的に室温でoxycarbonated ACSFを灌流。温度は、バイポーラの温度コントローラを用いて適応させることができる。
- ロードされたVNOスライス（ 図3C - E）の観測は、25倍または63x客観的かつクールSNAP - HQのカメラで、倒立蛍光顕微鏡で実行されます。照明は、ポリクロメータの楽器で（380分の340 nm）を連続して行われ、5Hzのの速度で記録されます。フィルタリングされた放射は510 nmで行われます。細胞内カルシウムの比率の変化（ΔF= 340 nm/380 nm）は適切なソフトウェアを使用して監視されます。
- Chemostimulationは、あなた自身の実験目的に応じて適宜選択されるべきである。ここでは、フェロモンMを含むACSFのperfusionsIX（イソブチルアミン、2 -ヘプタノン、4 -ヘプタノン、2 -ヘプタノール、pentylacetate、dimethylpyrazine、α/β-ファルネセン、10 -6 M）、2 -ヘプタノン（10 -6 M）またはたての（1オスとメス収集： 1）マウスの尿（1:100）が32を実行している。 ATP（125μM）の灌流は、実験の終了時に実行可能性のテストとして使用されます（ 図3F）と約80％生存ニューロンの割合を示す必要があります。これらの条件下で、スライスは2時間まで使用することができます。
- 感覚ニューロンのGFPタグ亜集団は、特定の照明（ここV1rb2表現する神経細胞）によって可視化されると（ 図3G - I）を正確に分析することができます。
5。代表的な結果：
多形質導入マウスVNOで行われている、または新たなフェロモン受容体のペアを識別するための経路を調査する機能アッセイを確立するために、我々は、VGマウスライン（ 図1Aを活用する図1E）の抽出と解剖の後、我々は急性VNOスライス（ 図2C）を用意する。我々は、アセチル化チューブリン蛋白質（ 図2D - F）に対してimmunohistostainingsを実行することで、準備のtissular整合性をチェックし、検証するために、それらの一部を修正。スライスの他の画分をカルシウムイメージング実験に使用されます。そのためには、スライスはフラ- 2AM（ 図3C - E）によってロードされ、各ニューロンの細胞内カルシウムレベルは、ΔFの比（ 図3F）として監視されます。ニューロンの生存性は、ΔF比の迅速かつ一時的な増加が（ 図3F）期待される後、ATPの灌流（125μM）によって評価されます。フェロモンの主要な供給源である尿、新鮮なの灌流LY収集したマウスの尿（1:100）は、内在性コントロールとして使用されます。それは、記録されたニューロン（セル1と2、 図3F）の約50％のカルシウムトランジェントをトリガします。 GFP照明の下、V1Rb2陽性ニューロンは、2 -ヘプタノン、観察、およびその既知のフェロモンリガンドの灌流され、細胞の活性化を（セル1、 図3I）を開始します。興味深いことに、神経細胞のアクティベーションは、VNOでコーディングフェロモンの複雑さを示す、V1Rb2受容体（GFP陰性ニューロン）（セル2、 図3I）を発現していないニューロンの割合で観測されています。
図1マウス鋤鼻器官の解剖。 VGのラインから（A）マウス。 （B）マウスの安楽死の後、完全な頭部は、双眼顕微鏡下に置かれており、下顎が口蓋を視覚化するために削除されます。小さな水平方向の切開が行われる（黒の破線）。 （C）口蓋を除去した後、VNOが並ぶ鼻中隔は、VNOの抽出を容易にするために上側と下側の部分（白点線）にカットされます。 （D）VNOは、ACSFのソリューション内に配置し、（挿入：二つの部分の高いパワービュー）分離されています。 （E）VNOの軟骨カプセルは微妙に削除され、その軟骨カプセルのないVNOは、実験の残りの部分に使用されます。スケールバーは以下のとおりです、1 mmに。
図2。マウスの鋤鼻急性スライス標本とtissular整合性。 （A）マウスVNOは垂直に寒天3％溶液に埋め込まれています。寒天の温度は41℃未満にする必要があります（B）寒天ブロックはピラミッド状の形状にカットされ、100μmのVNOのセクションは、（黒の破線）ACSFで生成されます。 （C）VNOのスライスは、特定のを可視化するために、蛍光実体顕微鏡下で選択することができます。タグ付けされた感覚ニューロンの人口。 （DF）Tissularの整合性は、アセチル化チューブリン蛋白質、準備の完璧な保護を実証V1rb2遺伝子標的ニューロンのより高い電力のビューに対してimmunohistostainingsによって評価することができる。内腔の表面（E）だけでなく、樹状ノブや微絨毛の構造タンパク質の発現に達した彼らの長い樹状突起を持つ神経細胞は、（F）を観察することができます。スケールバーは以下のとおりです。Bを5mm、C、60μmの、D、40μm以下、EF、20μmである。
図3。カルシウムイメージングと鋤鼻急性組織切片におけるフェロモンの検出。 （A）フラ- 2AMローディングフェーズの後、VNOのスライスは、灌流チャンバー内に配置され、適応アンカー（ハイパワービュー）で維持されます。 （B）実験が暗いとVNOスライスで実行される連続的に真空システムを用いてRTでACSFを灌流されています。温度はchosすることができますバイポーラペルティエ素子と熱プローブによって構成される温度制御装置のシステムを使用してエン。この特定の実験は室温で行った。 （CE）VNOのスライスは、（D）と神経細胞活性化（E、ここでATPを持つ）の間の前にホフマンの位相コントラスト（C、HV）やフラ380nmの照射下で観測されています。 （F）神経生存率は、ATP（125μM）の灌流で評価されます。ここで、chemostimulationは、尿（尿、1:100）、または165ミリリットル/ hの一定流量でマウスのフェロモンの混合（ミックスのpH。、10 -6 M）で行われます。細胞内カルシウム濃度（ΔF）（セル1〜3）各セルごとに個別に記録することができます。 （G）V1Rb2のニューロンがGFP照明（1）に基づく可視化です。 （H）このニューロン（1）と同様に非V1rb2表現するニューロン（2）の荷重が表示されます。 （I）V1rb2のニューロンは、細胞内カルシウムの増加とともに2 - ヘプタノンに対応することができます。この特定の非V1rb2表現するニューロンは、また、2 - ヘプタノン（セル2）に応答します。スケールバーは以下のとおりです。CE、20μm以下、GH、は15μm、ΔF= 340 nmの/ 380nmの。 （FおよびI）刺激のアプリケーションの持続時間は、各トレースの下のバーで示されます。任意のカラースケールは、蛍光強度を表します。
Discussion
ここで紹介するカルシウムイメージング法は、急性スライス標本では、マウスVNOニューロンのフェロモン応答を記録することができます。このアプローチでは、鋤鼻ニューロンに動物の解剖は、いくつかの練習で、容易に達成可能であり、長期生体組織の準備を提供します。それは、薬理学的調査やフェロモンのコーディングの研究のように時間のかかる実験をすることができます。この生理学的手法では、大規模な集団だけでなく、正確な神経細胞集団は、特に分析することができます。さらに、この方法は簡単に他のカルシウム色素に基づいて、免疫組織化学的なアプローチや実験に適応することができます。これらを組み合わせた方法論を使用すると、確実にマウス鋤鼻器官に発現し、多くの孤児の化学受容体の新たなフェロモンリガンドの同定が可能になります。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は彼の科学的なアドバイスや顕微鏡装置のUNILのイメージングCIFのプラットフォームのために特にモニークNenniger彼女の優秀な技術サポートのためのトサトだけでなく、ジャン=イヴチャットンに感謝したいと思います。資金は、スイス国立科学財団によって提供されていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
| Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
| CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
| Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck & Co., Inc. | 317275-100ML | |
| Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
| Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
| FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
| Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
| Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
| MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
| Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
| Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
| Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
| Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
| Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth GmbH | 0258.1 | |
| SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
| Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
| Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
| Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
| Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
| VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
| 3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |
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