בעכברים, היכולת לזהות פרומונים מתווכת בעיקר על ידי האיבר vomeronasal (VNO). כאן, רקמה חריפה פרוסה הכנת VNO לביצוע הדמיה סידן מתואר. גישה זו מאפשרת פיזיולוגיים תצפיות subpopulations ו / או נוירונים בודדים ברקמה חיה נוח זיהוי קולטן ליגנד.
פיטר Karlson ומרטין Lüscher השתמשו פרומון המונח לראשונה בשנת 1959 1 לתאר כימיקלים המשמשים לתקשורת תוך מינים. פרומונים הם נדיפים או בלתי נדיף קצרת מולקולות 2 מופרשים ו / או הכלול 3,4 נוזלים ביולוגיים, דוגמת שתן, נוזל ידוע להיות המקור העיקרי של פרומונים 3. תקשורת המושכת הוא מעורב במגוון רחב של שיטות חיה מפתח כגון אינטראקציות 5,6 קרובי משפחה, ארגוני היררכי 3 ואת האינטראקציות המיניות 7,8 ו – וכתוצאה מכך הם בקורלציה ישירה עם להישרדות המין נתון 9,10,11. בעכברים, היכולת לזהות פרומונים מתווכת בעיקר על ידי האיבר vomeronasal (VNO) 10,12, מבנה לזווג הממוקמת בבסיס של חלל האף, וגם מוקף כמוסת סחוסי. VNO לכל צורה צינורי עם לומן 13,14 המאפשר קשר עם חיצוניעולם כימי. Neuroepithelium חושית מורכבת בעיקר של נוירונים חושיים vomeronasal דו קוטבית (VSNs) 15. VSN כל משתרע דנדריט יחיד לומן שהסתיימו ידית הדנדריטים גדול נושאת עד 100 microvilli מעורב זיהוי כימי 16. Subpopulations רבים של VSNs נוכחים. הם מובחנים על ידי chemoreceptor שהם מבטאים, ובכך ככל הנראה על ידי ליגנד (ים) הם מכירים 17,18. שתי משפחות עיקריות קולטן vomeronasal, V1Rs ו V2Rs 19,20,21,22, מורכבים בהתאמה על ידי 240 23 120 24 חברים באים לידי ביטוי שכבות נפרדות של neuroepithelium. קולטני הריח (מחדרי) 25 ו קולטנים פפטיד formyl (FPRs) 26,27 באים לידי ביטוי גם VSNs.
בין אם אלה subpopulations העצבית להשתמש באותו מסלול איתות במורד הזרם עבור פרומונים חישה אינו ידוע. למרות התפקיד המרכזי של ערוץ הסידן חדיר-(TRPC2) נוכח microvilli של נוירונים בוגרים 28 TRPC2 ערוצי התמרה עצמאי הוצעו 6,29. בשל המספר הגבוה של תת עצב את המורפולוגיה המיוחדת של האיבר, חקירות פרמקולוגיות ופיזיולוגיות של אלמנטים איתות נוכח VNO מורכבים.
כאן, אנו מציגים רקמות חריפה פרוסה הכנה של VNO העכבר לביצוע הדמיה חקירות סידן. גישה זו מאפשרת פיזיולוגיים תצפיות בסביבה הטבעית של רקמה חיה, של subpopulations כללית או בודדים של VSNs נטען בעבר עם Fura, 02:00, צבע סידן. שיטה זו היא גם נוח לומד כל קולטן ה-GFP-tagged פרומון ו ניתנת להתאמה לשימוש אחר בדיקות סידן ניאון. כדוגמה, אנו משתמשים כאן עכבר VG קו 30, שבו תרגום של הקולטן פרומון V1rb2 קשורה הביטוי של ה-GFP על ידי אסטרטגיה polycistronic. </p>
הדמיה סידן השיטה המוצגת כאן מאפשרת להקליט, כהכנה פרוסה חריפה, המושכת את התגובות של נוירונים עכבר VNO. עם גישה זו, דיסקציה מן החיה אל הנוירונים vomeronasal היא, עם קצת תרגול, השגה בקלות ומספק הכנה ארוך רקמה חיה. זה מאפשר זמן רב ניסויים כמו חקירות תרופתי או לימוד של קידוד המושכת. בעזרת טכניקה זו פיזיולוגיים, אוכלוסיות גדולות, כמו גם subpopulations העצבית מדויק ניתן לנתח באופן ספציפי. בנוסף, בשיטה זו ניתן להתאים בקלות לגישות או ניסויים immunohistochemical המבוססת על צבעים סידן אחרים. השימוש בשיטות אלה בשילוב בוודאי לאפשר זיהוי של ligands המושכת חדש עבור chemoreceptors יתום רבים הביעו באיבר העכבר vomeronasal.
The authors have nothing to disclose.
אנו רוצים להודות במיוחד מוניק Nenniger Tosato לקבלת תמיכה טכנית מעולה שלה, כמו גם ז'אן איב Chatton עבור עצות המדעי שלו ואת פלטפורמת CIF הדמיה של UNIL עבור הציוד מיקרוסקופ. המימון ניתן על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck | 317275-100ML | |
Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth | 0258.1 | |
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |