マウスでは、フェロモンを検出する能力は、主に鋤鼻器官(VNO)によって媒介される。ここでは、カルシウムイメージングを行うためのVNOの急性組織のスライス標本が記載されている。この生理学的アプローチは、生体組織に集団および/または個々の神経細胞の観察を可能にし、受容体 – リガンドの識別に便利です。
ピーターカールソンとマーティンルッシャーは、イントラ種の通信に使用される化学物質を記述するために1959年1で初めて長期的フェロモンを使用していました。フェロモンは揮発性または不揮発性の短命な分子である2分泌および/ または尿など、フェロモン3の主な源であることが知られている液体のような生物学的流体3,4、に含まれている。フェロモンコミュニケーションは、親族間相互作用5,6、階層的な組織3、性的な相互作用7.8などの主要な動物のモダリティの多様に関与していると結果的に直接与えられた種9,10,11の生存と相関している。マウスでは、フェロモンを検出する能力は、主に鋤鼻器官(VNO)10,12、鼻腔の底部にある対になった構造によって媒介される、と軟骨カプセルに封入。各VNOは、外部との接触を可能にする内腔13,14と筒形状を有している化学の世界。感覚神経上皮は、主に鋤鼻バイポーラ感覚ニューロン(VSNを)15で構成されています。各VSNは、化学物質の検出16に関与する100絨毛まで付いた大きな樹のノブで終わる腔に単一の樹状突起を拡張します。 VSNの多数の亜集団が存在している。それらはおそらく彼らが17,18を認識するリガンド(s)でこのように表現し、化学受容器によって区別されます。二つの主要な鋤鼻受容体ファミリー、V1RsとV2Rs 19,20,21,22は 、240 23 120 24メンバーによってそれぞれ構成され、神経上皮の別々の層で表されます。嗅覚受容体(ORS)25とホルミルペプチド受容体(FPRの)26,27は、VSNをで表されます。
これらのニューロンの亜集団は、センシングフェロモンのために同じ下流のシグナル伝達経路を使用しているかどうかは不明です。カルシウム透過性チャネル(が果たす主要な役割にもかかわらず28 TRPC2独立した情報伝達のチャンネルが6,29を提案されている成熟した神経細胞の微絨毛に存在TRPC2)。神経細胞集団の数が多いとオルガンの独特な形態のために、VNOに存在するシグナル伝達要素の薬理学的および生理学的な調査は複雑です。
ここで、我々は、カルシウムイメージングの調査を行うためのマウスVNOの急性組織のスライス標本を提示する。この生理学的アプローチは、以前にフラ- 2AM、カルシウム色素でロードされたVSNの一般的なまたは個々の部分集団の生体組織の自然環境、で、観察することができます。このメソッドは、GFPタグ付きのフェロモン受容体を研究するにも便利ですし、他の蛍光カルシウムプローブの使用のための適応です。例として、我々はここにフェロモンV1rb2受容体の翻訳はポリシストロン戦略によるGFPの発現にリンクされているVGマウス30行目を 、使用してください。 </p>
ここで紹介するカルシウムイメージング法は、急性スライス標本では、マウスVNOニューロンのフェロモン応答を記録することができます。このアプローチでは、鋤鼻ニューロンに動物の解剖は、いくつかの練習で、容易に達成可能であり、長期生体組織の準備を提供します。それは、薬理学的調査やフェロモンのコーディングの研究のように時間のかかる実験をすることができます。この生理学的手法では、大規模な集団だけでなく、正確な神経細胞集団は、特に分析することができます。さらに、この方法は簡単に他のカルシウム色素に基づいて、免疫組織化学的なアプローチや実験に適応することができます。これらを組み合わせた方法論を使用すると、確実にマウス鋤鼻器官に発現し、多くの孤児の化学受容体の新たなフェロモンリガンドの同定が可能になります。
The authors have nothing to disclose.
我々は彼の科学的なアドバイスや顕微鏡装置のUNILのイメージングCIFのプラットフォームのために特にモニークNenniger彼女の優秀な技術サポートのためのトサトだけでなく、ジャン=イヴチャットンに感謝したいと思います。資金は、スイス国立科学財団によって提供されていました。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck | 317275-100ML | |
Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth | 0258.1 | |
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |