Farelerde, feromonları algılamak için yeteneği esas vomeronasal organ (VNO) tarafından aracılık eder. Burada, kalsiyum görüntüleme yapmak için VNO akut doku dilim hazırlık açıklanmıştır. Bu fizyolojik bir yaklaşımdır alt popülasyonlar ve / veya bireysel nöronlar gözlemleri yaşayan bir doku sağlar ve reseptör-ligand tanımlanması için uygundur.
Peter Karlson ve Martin Lüscher tür içi iletişim için kullanılan kimyasallar tanımlamak için ilk kez 1959 1 terimi feromon kullandı. Feromonlar, uçucu veya uçucu olmayan kısa ömürlü moleküllerdir 2 salgılanan ve / veya idrar, feromonlar 3 ana kaynak olduğu bilinen bir sıvı gibi biyolojik sıvılarda 3,4, içerdiği . Pheromonal iletişim kin etkileşimleri 5,6, hiyerarşik örgütler 3 ve cinsel etkileşimleri 7,8 gibi önemli hayvan yöntemlerinin çeşitli karıştığı ve dolayısıyla belirli bir türün 9,10,11 sağkalım ile doğrudan ilişkilidir. Farelerde, feromonları algılamak için yeteneği esas vomeronasal organ (VNO) 10,12, burun boşluğunun tabanında bulunan eşleştirilmiş bir yapı tarafından aracılık ve kıkırdak kapsül içine. Her VNO harici ile temas sağlayan bir lümen 13,14 ile tübüler bir şekilkimyasal dünya. Duyusal neuroepithelium esas vomeronasal bipolar duyu nöronları (VSNs) 15 oluşur. Her VSN kimyasal algılama 16 karıştığı 100 mikrovilluslar kadar taşıyan büyük bir dendritik topuzu ile biten lümen tek bir dendrit uzanır. VSNs, çok sayıda alt popülasyonlar mevcuttur. 17,18 farkındayız ligand (ler) tarafından muhtemelen bu nedenle ifade ve kemoreseptör ile ayırt edilirler. İki ana vomeronasal reseptör aileler, V1Rs ve V2Rs 19,20,21,22, 240 23 ve 120 24 üye sırasıyla oluşur ve neuroepithelium ayrı katmanlar olarak ifade edilir. Olfaktör reseptörleri (OO) 25 ve formil peptid reseptörleri (FPRs) 26,27 VSNs da ifade edilir.
Bu algılama feromonlar nöronal alt popülasyonlar için olsun ya da olmasın aynı downstream sinyal yolağı bilinmemektedir. Geçirgen bir kalsiyum kanal (tarafından oynanan önemli bir rol rağmenOlgun nöronlar, 28 TRPC2 bağımsız transdüksiyon kanal mikrovilluslar TRPC2) 6,29 öne sürülmüştür . Nöronal alt popülasyonlar ve organın kendine özgü morfoloji sayısının yüksek olması nedeniyle, farmakolojik ve fizyolojik araştırmalar VNO sinyal elemanlarının karmaşıktır.
Burada, kalsiyum görüntüleme incelemeler yapmak için fare VNO akut doku dilim hazırlık mevcut. Bu fizyolojik bir yaklaşım, daha önce Fura-02:00, kalsiyum boya yüklü VSNs genel veya bireysel alt popülasyonlar, doğal ortamda yaşayan bir doku, gözlem sağlar. Bu yöntem, herhangi bir GFP etiketli feromon reseptör eğitim için de uygundur ve diğer floresan kalsiyum problar kullanım için uyarlanabilir. Örnek olarak, biz burada, feromon V1rb2 reseptör çeviri GFP ifade polycistronic stratejisi ile bağlantılı olduğu VG fare hattı 30, kullanırlar . </p>
Burada sunulan kalsiyum görüntüleme yöntemi, akut bir dilim hazırlık, fare VNO nöronların pheromonal yanıtları kaydetmenize olanak tanır. Bu yaklaşımla, vomeronasal nöronlar hayvan diseksiyonu, bazı uygulama ile kolayca ulaşılabilir ve uzun yaşayan bir doku hazırlık sağlar. Farmakolojik pheromonal kodlama soruşturma ya da çalışma gibi zaman alıcı deneyler sağlar. Bu fizyolojik tekniği ile, büyük nüfusları kesin nöronal alt popülasyonlar yanı sıra özel olarak analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu yöntem kolayca diğer kalsiyum boyalar dayalı immünohistokimyasal yaklaşımlar veya deneylere adapte olabilir. Bu kombine metodolojilerin kullanımı kesinlikle fare vomeronasal organ ifade edilen çok sayıda yetim kemoreseptörlerin için yeni pheromonal ligandların kimlik sağlayacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Biz özellikle Monique Nenniger onun mükemmel teknik destek için Tosato yanı sıra Jean-Yves Chatton yaptığı bilimsel tavsiye ve mikroskop ekipman için UNIL görüntüleme CIF platformu için teşekkür etmek istiyorum. Finansman, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından sağlanmıştır.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck | 317275-100ML | |
Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth | 0258.1 | |
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |