Em camundongos, a capacidade de detectar os feromônios é principalmente mediado pelo órgão vomeronasal (OVN). Aqui, uma preparação fatia aguda do tecido de VNO para a realização de imagens de cálcio é descrito. Esta abordagem permite observações fisiológicos de subpopulações e / ou neurônios individuais em um tecido vivo e é conveniente para receptor-ligante de identificação.
Peter Karlson e Lüscher Martin usou o termo feromônio pela primeira vez em 1959 para descrever um produtos químicos utilizados para a comunicação intra-espécies. Feromônios são voláteis e não-voláteis de curta duração moléculas secretadas 2 e / ou contidas em fluidos biológicos 3,4, como a urina, um líquido conhecido por ser a principal fonte de feromônios 3. Comunicação pheromonal está implicado em uma variedade de modalidades de animais chave, tais como interações familiares 5,6, organizações hierárquicas 3 e 7,8 interações sexuais e são, consequentemente, diretamente correlacionado com a sobrevivência de uma dada espécie 9,10,11. Em camundongos, a capacidade de detectar os feromônios é principalmente mediado pelo órgão vomeronasal (VNO) 10,12, uma estrutura pareada localizada na base da cavidade nasal, e fechado em uma cápsula cartilaginosa. Cada VNO tem uma forma tubular com um lúmen 13,14 permitindo o contato com o externomundo químico. O neuroepitélio sensorial é composto principalmente de neurônios sensoriais bipolares vomeronasal (VSNs) 15. Cada VSN estende um único dendrito para o lúmen que termina em um botão dendríticas grande influência até 100 microvilosidades implicados na detecção química 16. Subpopulações de numerosos VSNs estão presentes. Eles são diferenciados pelos quimiorreceptores eles expressam e, portanto, possivelmente pelo ligante (s) que reconheçam 17,18. Duas principais famílias receptor vomeronasal, V1Rs e V2Rs 19,20,21,22, são compostas respectivamente por 240 e 120 23 24 membros e são expressos em camadas separadas do neuroepitélio. Receptores olfativos (ORs) 25 e receptores de peptídeos formil (FPRs) 26,27 também estão expressos em VSNs.
Ou não essas subpopulações neuronais use o caminho downstream mesmo sinalização para feromônios de sensoriamento é desconhecida. Apesar de um papel de destaque desempenhado por um cálcio permeável canais (TRPC2) presentes na microvilosidades de neurônios maduros TRPC2 28 canais de transdução independentes têm sido sugeridas 6,29. Devido ao elevado número de sub-populações neuronais ea morfologia peculiar do órgão, investigações farmacológicas e fisiológicas dos elementos de sinalização presente no VNO são complexas.
Aqui, apresentamos uma preparação fatia aguda do tecido do VNO do mouse para a realização de exames imagiológicos de cálcio. Esta abordagem permite observações fisiológicas, no ambiente natural de um tecido vivo, de subpopulações geral ou individual de VSNs previamente carregado com Fura-02:00, um corante de cálcio. Este método também é conveniente para estudar qualquer GFP-tagged receptor de feromônio e é adaptável para o uso de outras sondas fluorescentes de cálcio. Como exemplo, usamos aqui um rato VG linha 30, em que a tradução do receptor de feromônio V1rb2 está ligada à expressão de GFP por uma estratégia polycistronic. </p>
O método de imagem de cálcio apresentado aqui permite gravar, em uma preparação fatia aguda, as respostas dos neurônios de rato pheromonal VNO. Com esta abordagem, a dissecção do animal para os neurônios vomeronasal é, com alguma prática, facilmente alcançável e oferece uma preparação de tecido de longa vida. Ele permite demorado experimentos como estudos farmacológicos ou o estudo de codificação pheromonal. Com esta técnica fisiológica, grandes populações, bem como precisa subpopulações neuronal pode ser analisado especificamente. Além disso, este método pode ser facilmente adaptado às abordagens imuno-histoquímica ou experimentos com base em corantes de cálcio outros. O uso destas metodologias combinadas certamente irá permitir a identificação de novos ligantes pheromonal para os quimiorreceptores muitos órfãos expressas no órgão vomeronasal do mouse.
The authors have nothing to disclose.
Queremos agradecer especialmente Monique Nenniger Tosato por sua excelente suporte técnico, bem como Jean-Yves Chatton para seus conselhos científicos ea imagem plataforma CIF da UNIL para o equipamento de microscópio. O financiamento foi fornecido pelo National Science Foundation suíço.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck | 317275-100ML | |
Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth | 0258.1 | |
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |