Bij muizen, is de mogelijkheid om feromonen te detecteren hoofdzakelijk gemedieerd door de vomeronasale orgaan (VNO). Hier is een acute weefsel stuk voorbereiding van VNO voor het uitvoeren van calcium beeldvorming beschreven. Deze fysiologische aanpak maakt het mogelijk waarnemingen van subpopulaties en / of individuele neuronen in een levend weefsel en is handig voor het receptor-ligand identificatie.
Peter Karlson en Martin Lüscher gebruikte de term feromoon voor de eerste keer in 1959 1 tot en met chemicaliën die worden gebruikt voor het binnen dezelfde soort communicatie te beschrijven. Feromonen zijn vluchtige of niet-vluchtige korte duur moleculen twee afgescheiden en / of in biologische vloeistoffen 3,4, zoals urine, een vloeistof waarvan bekend is dat een belangrijke bron van feromonen 3. Pheromonal communicatie is betrokken bij een groot aantal belangrijke dierlijke modaliteiten zoals verwanten interacties 5,6, hiërarchische organisaties 3 en seksuele interacties 7,8 en zijn dus direct gecorreleerd met de overleving van een bepaalde soort 9,10,11. Bij muizen, is de mogelijkheid om feromonen te detecteren hoofdzakelijk gemedieerd door de vomeronasale orgaan (VNO) 10,12, een gepaarde structuur gelegen aan de voet van de neusholte, en opgesloten in een capsule kraakbeen. Elke VNO heeft een buisvormige vorm met een lumen 13,14 waardoor het contact met de externechemische wereld. De sensorische neuroepithelium bestaat voornamelijk uit vomeronasal bipolaire sensorische neuronen (VSNs) 15. Elke VSN strekt zich een enkele dendrieten naar het lumen eindigend in een grote knop met dendritische tot 100 microvilli betrokken bij chemische detectie 16. Talrijke subpopulaties van VSNs aanwezig zijn. Ze worden onderscheiden door de chemoreceptor ze uitdrukken en dus eventueel door de ligand (s) ze herkennen 17,18. Twee belangrijke vomeronasal receptor families, V1Rs en V2Rs 19,20,21,22, worden respectievelijk samengesteld door 240 23 en 120 24 leden en worden uitgedrukt in afzonderlijke lagen van de neuroepithelium. Olfactorische receptoren (OR's) 25 en formyl peptide receptoren (FPRs) 26,27 worden ook uitgedrukt in VSNs.
Of deze neuronale subpopulaties gebruik van dezelfde downstream-signaleringsroute voor het waarnemen van feromonen is onbekend. Ondanks een grote rol gespeeld door een calcium-permeabel kanaal (TRPC2) aanwezig in de microvilli van de volwassen neuronen 28 TRPC2 onafhankelijke transductie kanalen zijn voorgesteld 6,29. Vanwege het hoge aantal van neuronale subpopulaties en de eigenaardige morfologie van het orgel, farmacologische en fysiologische onderzoeken van de signalering elementen aanwezig zijn in het VNO zijn complex.
Hier presenteren we een acute weefsel plak de voorbereiding van de muis VNO voor het uitvoeren van calcium imaging onderzoek. Deze fysiologische aanpak maakt het mogelijk waarnemingen, in de natuurlijke omgeving van een levend weefsel, van algemene of individuele subpopulaties van VSNs eerder geladen met Fura-2AM, een calcium kleurstof. Deze methode is ook geschikt voor het bestuderen van een GFP-gelabelde feromoon receptor en is aanpasbaar voor het gebruik van andere fluorescerende probes calcium. Als voorbeeld gebruiken we hier een VG muis lijn 30, waarbij de vertaling van het feromoon V1rb2 receptor is om de expressie van GFP met elkaar verbonden door een polycistronisch strategie. </p>
De calcium-imaging methode hier voorgesteld in staat stelt om, op te nemen in een acute slice voorbereiding, de pheromonal reacties van de muis VNO neuronen. Met deze aanpak, dissectie van het dier naar de vomeronasale neuronen is, met enige oefening, gemakkelijk bereikbaar en biedt een lange-levend weefsel voorbereiding. Het maakt tijdrovende experimenten zoals farmacologische onderzoek of de studie van pheromonal codering. Met deze fysiologische techniek kunnen grote populaties, alsmede nauwkeurige neuronale subpopulaties bijzonder aandacht worden besteed. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden aangepast aan immunohistochemische benaderingen of experimenten gebaseerd op andere calcium-kleurstoffen. Het gebruik van deze gecombineerde methodieken zal zeker de identificatie van nieuwe pheromonal liganden voor de vele wees chemoreceptoren, uitgedrukt in de muis vomeronasale orgaan.
The authors have nothing to disclose.
We willen in het bijzonder Monique Nenniger Tosato voor haar uitstekende technische ondersteuning en Jean-Yves Chatton bedanken voor zijn wetenschappelijke adviezen en de beeldvorming CIF platform van de UNIL voor de microscoop apparatuur. De financiering werd verstrekt door de Zwitserse National Science Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck | 317275-100ML | |
Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth | 0258.1 | |
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |