Hos mus, er evnen til at detektere feromoner hovedsageligt medieres af vomeronasal organ (VNO). Her er en akut væv skive forberedelse af VNO for udførelsen af calcium imaging beskrevet. Denne fysiologiske tilgang giver mulighed for observationer af delpopulationer og / eller individuelle neuroner i et levende væv og er praktisk for receptor-ligand identifikation.
Peter Karlson og Martin Lüscher brugt udtrykket feromon for første gang i 1959 1 for at beskrive kemikalier, der anvendes til inden for samme art kommunikation. Feromoner er flygtige eller ikke-flygtige kortlivede molekyler 2 udskilles og / eller er indeholdt i biologiske væsker 3,4, såsom urin, en væske er kendt for at være en væsentlig kilde til feromoner 3. Pheromonal kommunikation er impliceret i en lang række vigtige dyr modaliteter såsom pårørende interaktioner 5,6, hierarkiske organisationer, 3 og seksuel interaktion 7,8 og er dermed direkte korreleret med overlevelse af en bestemt art 9,10,11. Hos mus, er evnen til at detektere feromoner hovedsageligt medieres af vomeronasal organ (VNO) 10,12, en parret struktur placeret i bunden af næsehulen, og indkapslet i en bruskspidserne kapsel. Hver VNO har en rørformet form med en lumen 13,14 tillader kontakt med eksternekemiske verden. Den sensoriske neuroepithelium er hovedsagelig sammensat af vomeronasal bipolar sensoriske neuroner (VSNs) 15. Hver VSN udvider en enkelt dendritceller til lumen ender i en stor dendritiske knop med op til 100 microvilli indblandet i kemisk sporingsudstyr 16. Talrige delpopulationer af VSNs er til stede. De er differentieret ved den kemoreceptorernes de giver udtryk for, og dermed muligvis den ligand (r) de genkender 17,18. To vigtige vomeronasal receptor familier, V1Rs og V2Rs 19,20,21,22, er sammensat af henholdsvis 240 23 og 120 24 medlemmer og er udtrykt i separate lag af neuroepithelium. Olfaktoriske receptorer (OR) 25 og formyl peptid receptorer (FPRs) 26,27 er også udtrykt i VSNs.
Hvorvidt disse neuronale delpopulationer bruge den samme downstream signalvejen for sensing feromoner er ukendt. På trods af en væsentlig rolle, som en calcium-gennemtrængelig kanal (TRPC2) til stede i microvilli af modne neuroner 28 TRPC2 uafhængige transduktion kanaler er blevet foreslået 6,29. På grund af det store antal neuronale delpopulationer, og den ejendommelige morfologi af orglet, farmakologiske og fysiologiske undersøgelser af signalsystemet elementer til stede i VNO er komplekse.
Her præsenterer vi en akut væv skive udarbejdelsen af musen VNO til udførelse af calcium billeddannelse undersøgelser. Denne fysiologiske tilgang giver bemærkninger, det naturlige miljø i en levende væv, af generelle eller individuelle delpopulationer af VSNs tidligere læsset med Fura-2:00, et calcium farvestof. Denne metode er også praktisk, til at undersøge GFP-tagget feromon receptoren og kan tilpasses til brug af andre fluorescerende calcium sonder. Som et eksempel bruger vi her en VG mus linje 30, hvor oversættelsen af feromon V1rb2 receptoren er knyttet til udtryk for GFP ved en polycistronic strategi. </p>
Den calcium imaging metode præsenteret her giver mulighed for at registrere, i en akut skive forberedelse, pheromonal svarene fra musen VNO neuroner. Med denne fremgangsmåde, er dissektion fra dyr til vomeronasal neuroner, med lidt øvelse, let opnåelige og giver en lang-levende væv forberedelse. Det giver mulighed for tidskrævende eksperimenter lignende farmakologiske undersøgelser og studiet af pheromonal kodning. Med denne fysiologiske teknik, kan store befolkninger samt præcise neuronal delpopulationer blive analyseret specifikt. Desuden kan metoden nemt tilpasses til immunohistokemiske tilgange eller eksperimenter baseret på andre calcium farvestoffer. Brugen af disse kombinerede metoder vil helt sikkert føre til identifikation af nye pheromonal ligander for de mange forældreløse chemoreceptors udtrykt i mus vomeronasal orgel.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke især Monique Nenniger Tosato for hendes fremragende tekniske support samt Jean-Yves Chatton for hans videnskabelige råd og de billeddannende CIF platform UNIL for mikroskopet udstyr. Finansieringen blev leveret af den schweiziske National Science Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck | 317275-100ML | |
Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth | 0258.1 | |
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |