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Neuroscience

इमेजिंग pheromone एक माउस vomeronasal तीव्र ऊतक स्लाइस तैयारी में सेंसिंग

Published: December 6, 2011 doi: 10.3791/3311
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Lausanne, 2Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

Summary

चूहों में, pheromones का पता लगाने की क्षमता मुख्य vomeronasal अंग (VNO) द्वारा मध्यस्थता है. यहाँ, कैल्शियम इमेजिंग प्रदर्शन के लिए एक तीव्र ऊतक VNO का टुकड़ा तैयारी में वर्णित है. यह शारीरिक दृष्टिकोण एक ऊतक रहने में subpopulations और / या व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की टिप्पणियों की अनुमति देता है और रिसेप्टर ligand की पहचान के लिए सुविधाजनक है.

Protocol

1. माउस VNO के विच्छेदन

  1. वयस्क चूहे का प्रयोग करें. के रूप में फेरोमोन संवेदन multimodalities में फंसा है, उपभेदों, जीनोटाइप, लिंगों और उम्र के बीच भेद सावधान महत्वपूर्ण है और अपने परिणामों को प्रभावित करेंगे. यहाँ, हम वयस्क VG 30 चूहों पहले एक pheromone रिसेप्टर (2 heptanone - V1rb2) जोड़ी 31 (छवि 1A) की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता का चयन करें.
  2. विच्छेदन शुरू करने से पहले, ताजा ठंड कृत्रिम cerebro - रीढ़ की हड्डी द्रव तैयार (ACSF; NaCl 118 मिमी, NaHCO 3 25 मिमी, डी ग्लुकोज 10 मिमी, KCl 2 मिमी, 2 2 मिमी MgCl, नाह 2 पीओ 4 1.2 मिमी, 2 CaCl 2 मिमी, 7.4 पीएच) oxycarbon के साथ संतृप्त (95% 2 हे: 5% सीओ 2). उस के लिए, CaCl 2 को छोड़कर सभी ACSF घटक मिश्रण. सीधे oxycarbon साथ बुदबुदाती द्वारा समाधान तर. अंत में, CaCl 2 जोड़ने और 2 0 DDH साथ वांछित मात्रा को समायोजित. यू जब तक बर्फ पर ACSF समाधान रखेंसे.
  3. माउस के इच्छामृत्यु preferentially प्रयोग से पहले ही गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था के द्वारा या सीओ 2 साँस लेना द्वारा किया जाना चाहिए.
  4. माउस सिर कट. यह लगातार oxycarbonated ठंड ACSF में एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत रखें.
  5. निचले जबड़े कट और सिर की स्थिति क्रम में तालू (छवि 1B) कल्पना.
  6. एक चीरा क्षैतिज तालू के ऊपरी सूक्ष्म कैंची के साथ भाग में (छवि 1B) और सूक्ष्म विदारक संदंश के साथ तालु झिल्ली को हटा दें. हाइड्रेट और ACSF (छवि 1C) के साथ उजागर गुहा को साफ.
  7. ऊपरी कट और नाक पट (छवि 1C) के निचले हिस्से. नाजुक नाक VNO युक्त पट निकालने और इसे सीधे बर्फ (छवि 1D) पर ACSF में जगह है .
  8. खड़ी VNO के दो भागों सूक्ष्म विदारक संदंश का उपयोग कर अलग और नाजुक VNO के कार्टिलेजीनस कैप्सूल (हटायेंचित्र 1E). सुनिश्चित करें कि है कि सभी कार्टिलेजीनस टुकड़ों को हटा रहे हैं.

2. VNO ऊतक टुकड़ा तैयारी

VNO ऊतक टुकड़ा इस धारा 2) में वर्णित तैयारी कैल्शियम इमेजिंग जांच के लिए मुख्य रूप से है. VNO स्लाइस भी अस्थायी स्लाइस पर immunohistostainings के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ऊतक के संरचनात्मक अखंडता प्रोटोकॉल (कृपया 3 अनुभाग देखें)) को सत्यापित.

  1. कम पिघलने अगर (मानक पीबीएस में 3%) और अपने काम की जगह तैयार. आप ACSF, एक सूक्ष्म तक्षणी और समर्थन करता है, माइक्रो विदारक संदंश की जरूरत है, नए नए साँचे एम्बेडिंग (22 x 22 x 20 मिमी), सटीक पोंछे, ब्रश, टिशू कल्चर प्लेटें, cyanacrylat गोंद, बर्फ और एक थर्मामीटर.
  2. 3% अगर कम पिघलने के साथ एम्बेड मोल्ड भरें. सुनिश्चित करें कि तापमान 41 की तुलना में अधिक नहीं है डिग्री सेल्सियस खड़ी शीघ्र ही नष्ट (छवि 2A) VNO राज्याभिषेक स्लाइसें प्राप्त करने में सक्षम होना रखने से पहले.
  3. बर्फ पर एम्बेड मोल्ड प्लेसsolidification जब तक 1 मिनट और फिर के लिए यह अगर ब्लॉक से अलग है. एक पिरामिड आकार में अगर ब्लॉक कट और सूक्ष्म तक्षणी समर्थन (छवि 2B) पर गोंद के साथ जगह.
  4. सूक्ष्म तक्षणी साथ राज्याभिषेक VNO स्लाइस काटें, और 0.5 मिमी /, 0.7 मिमी की एक आयाम और ठंड ACSF में 100 सुक्ष्ममापी की एक मोटाई के एक गति के साथ एक ब्रश के साथ उन्हें ठंड के साथ भरा एक टिशू कल्चर थाली में रखने से पहले ऊतकों स्लाइस इकट्ठा ACSF.
  5. यदि आपके स्लाइस GFP तरह अंतर्जात प्रतिदीप्ति (जीन लक्षित न्यूरॉन्स में) होते हैं तो आप उन्हें एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope (छवि 2C) के तहत का चयन कर सकते हैं.

3. VNO अस्थायी स्लाइस पर immunohistochemistry

इस प्रक्रिया के लक्ष्य VNO ऊतक 2 खंड में प्राप्त स्लाइस) की अखंडता को सत्यापित करने के लिए है. Acetylated - ट्यूबिलिन microtubule / cytoskeleton VNO संवेदी न्यूरॉन्स की dendrites और microvilli में व्यक्त मार्कर है. कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों के लिए, जाने के निदेशकtly के लिए प्रोटोकॉल के 4 अनुभाग). अस्थायी VNO स्लाइस पर immunohistostaining विधि ब्याज की किसी भी प्रोटीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस प्रयोजन के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि 4 में 1 के लिए आप VNO ° ठीक सी एक लगानेवाला समाधान में (paraformaldehyde Pbs, 7.6 पीएच में 4%) 1.7 बिंदु के बाद) और इस बिंदु पीबीएस से प्रोटोकॉल का उपयोग के बजाय 7.6 पीएच पर ACSF समाधान.

  1. टिशू कल्चर थाली में एक लगानेवाला समाधान में ब्याज की अपने स्लाइस 1 (paraformaldehyde Pbs, 7.6 पीएच में 4%) में 4 डिग्री सेल्सियस तय
  2. पीबीएस 0.5% पर 10% और Triton एक्स 100 NGS (सामान्य सीरम बकरी) युक्त समाधान में अपने ऊतक 4 बजे रातोंरात स्लाइस ° सी ब्लॉक.
  3. 16h के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ स्लाइसें (विरोधी acetylated - ट्यूबिलिन, माउस, 1:2000) पीबीएस 0.25% पर NGS 5% और Triton एक्स 100 युक्त समाधान में कमरे के तापमान (आरटी) में सेते हैं.
  4. एक पीबीएस NGS 2% से युक्त समाधान के साथ 5 मिनट के लिए 3 बार धोएं.
  5. Seco के साथ अंधेरे में सेतेपीबीएस NGS आरटी पर 1 के लिए 2% से युक्त समाधान में ndary एंटीबॉडी (Cy5 संयुग्मित बकरी विरोधी - माउस, 1:200).
  6. NGS 2% से युक्त पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 3 बार धो, Pbs 1% और केवल पीबीएस NGS.
  7. उन्हें हाइड्रोफोबिक सीमांकित क्षेत्र (एक hydrophobic कलम का उपयोग करें) के केंद्र में रखकर एक फ्लोरोसेंट बढ़ते मीडिया (युक्त या नहीं DAPI) में अपने स्लाइस और माउंट coverslips साथ स्लाइस को कवर.
  8. Confocal माइक्रोस्कोपी और एक 3D पुनर्निर्माण (छवि 2 डी एफ) की अनुमति सॉफ्टवेयर के साथ टिप्पणियों और अधिग्रहण करें.

4. VNO स्लाइस पर कैल्शियम इमेजिंग

  1. निम्न कार्यविधियों अंधेरे में जगह ले जाएगा. सेते 1 के लिए 37 VNO स्लाइस ° सी और एक लोडिंग के साथ ठंड ACSF की रचना (7 सुक्ष्ममापी, 1 मिमी की DMSO में स्टॉक समाधान) Fura - 02:00 समाधान में pluronic 0.1% (w / v, शेयर 20% से कम 2 DDH में समाधान हे).
  2. उपयोग जब तक oxycarbonation के साथ बर्फ पर भरी हुई स्लाइस रखें. भरा हुआ स्लाइस के लिए रखा जा सकता है है3 - 4.
  3. एक छिड़काव ACSF युक्त कक्ष में एक ब्रश के साथ भरी हुई स्लाइस रखें और बनाए रखने के एक ऊतक टुकड़ा लंगर (छवि 3A) के साथ स्लाइस.
  4. एक कैल्शियम इमेजिंग खुर्दबीन (3B छवि) की अवस्था पर छिड़काव कक्ष प्लेस और लगातार आरटी पर oxycarbonated ACSF के साथ छिड़कना . तापमान एक द्विध्रुवी तापमान नियंत्रक के उपयोग के साथ अनुकूलित किया जा सकता है.
  5. लोड VNO स्लाइस (छवि -3 सी ई) के प्रेक्षणों के एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ एक 25x या 63x उद्देश्य और एक शांत स्नैप - मुख्यालय कैमरा के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. प्रदीप्ति क्रमिक रूप से किया जाता है (340 / 380 एनएम) और एक polychromator उपकरण के साथ 5Hz की दर पर दर्ज है. छानने का उत्सर्जन 510 एनएम पर किया जाता है. Intracellular कैल्शियम अनुपात परिवर्तन (ΔF = 340 nm/380 एनएम) एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ निगरानी कर रहे हैं.
  6. Chemostimulation अपने खुद के प्रयोगात्मक उद्देश्य के लिए अनुसार चुना जाना चाहिए. यहाँ, ACSF के perfusions फेरोमोन मीटर युक्त(isobutylamine, 2 heptanone, 4 heptanone, 2 heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β farnesene, 10 एम -6) ix, 2 heptanone (10 एम -6) या हौसले से पुरुष और महिला एकत्र (1: 1) माउस मूत्र (1:100) 32 प्रदर्शन कर रहे हैं. एटीपी (125 सुक्ष्ममापी) के छिड़काव प्रयोगों के अंत में एक व्यवहार्यता परीक्षण के रूप में प्रयोग किया जाता है (3F छवि) और लगभग 80% व्यवहार्य न्यूरॉन्स के अनुपात का संकेत चाहिए . इन शर्तों के तहत, स्लाइस 2 घंटे के लिए किया जा इस्तेमाल किया जा सकता है.
  7. संवेदी न्यूरॉन्स की GFP टैग subpopulations विशिष्ट रोशनी (यहाँ V1rb2 व्यक्त न्यूरॉन्स) द्वारा कल्पना कर रहे हैं और ठीक विश्लेषण किया जा सकता है (छवि 3 जी - मैं).

5. प्रतिनिधि परिणाम:

बहु पारगमन रास्ते माउस VNO में जगह ले, या नए फेरोमोन रिसेप्टर जोड़े की पहचान की जांच करने के लिए एक कार्यात्मक परख स्थापित, हम VG माउस लाइन (छवि 1A का लाभ ले लो (छवि 1E) के विच्छेदन के बाद, हम तीव्र VNO स्लाइस (छवि 2C) तैयार करते हैं . हम उनमें से एक अंश को ठीक करने के लिए, क्रम में जाँच करें और acetylated - ट्यूबिलिन प्रोटीन (छवि 2 डी एफ) के खिलाफ immunohistostainings प्रदर्शन करके तैयारी के tissular अखंडता को मान्य. स्लाइस के अन्य अंश कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है. उस के लिए, स्लाइस Fura - 02:00 (छवि -3 सी ई) के साथ भरी हुई हैं और प्रत्येक न्यूरॉन के intracellular कैल्शियम का स्तर एक ΔF अनुपात (3F छवि) के रूप में नजर रखी है. न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता एटीपी (125 सुक्ष्ममापी), के छिड़काव द्वारा मूल्यांकन किया जाता है जिसके बाद ΔF अनुपात के तेजी से और क्षणिक वृद्धि की उम्मीद है (3F छवि). Pheromones का एक प्रमुख स्रोत होने के मूत्र के छिड़काव ताजाly एकत्र माउस मूत्र (1:100) एक अंतर्जात नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है. यह दर्ज न्यूरॉन्स (1 सेल और 2, अंजीर 3F.) का लगभग 50% में कैल्शियम यात्रियों से चलाता है. GFP रोशनी के तहत, V1Rb2 सकारात्मक न्यूरॉन्स नमूदार हैं और अपनी ज्ञात pheromonal ligand, 2-heptanone के छिड़काव सेलुलर सक्रियण (1 सेल, अंजीर 3I.) शुरू. दिलचस्प है, neuronal सक्रियकरण न्यूरॉन्स कि V1Rb2 रिसेप्टर (GFP नकारात्मक न्यूरॉन्स) (2 सेल, अंजीर 3I.) व्यक्त नहीं, फेरोमोन VNO में कोडिंग की जटिलता का प्रदर्शन का एक अंश में भी नमूदार हैं .

चित्रा 1
चित्रा 1 माउस vomeronasal अंग के विच्छेदन. (ए) वी.जी. लाइन से एक माउस. (बी) माउस के इच्छामृत्यु के बाद, पूरा सिर एक द्विनेत्री खुर्दबीन के नीचे रखा है और निचले जबड़े निकाल दिया जाता है क्रम में तालू कल्पना. एक छोटे क्षैतिज चीरा किया जाता है(काले धराशायी लाइन). (सी) तालु के हटाने के बाद, नाक VNO के साथ पंक्तिवाला पट ऊपरी में कट जाता है और निचले हिस्से (सफेद धराशायी लाइनों) VNO निकासी की सुविधा के लिए. (डी) VNO ACSF समाधान में तैनात है और अलग (सम्मिलित: दो भागों की उच्च शक्ति दृश्य). (ई) VNO के कार्टिलेजीनस कैप्सूल नाजुक, निकाल दिया जाता है और अपने कार्टिलेजीनस कैप्सूल बिना VNO प्रयोगों के आराम के लिए प्रयोग किया जाता है. बीई, 1 मिमी: स्केल सलाखों के हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. माउस vomeronasal तीव्र टुकड़ा तैयारी और tissular अखंडता. (ए) माउस VNO खड़ी अगर 3% समाधान में एम्बेडेड है. अगर का तापमान 41 डिग्री सेल्सियस से कम होना चाहिए (बी) अगर ब्लॉक एक पिरामिड आकार में काट रहा है और 100 सुक्ष्ममापी VNO वर्गों (काले धराशायी लाइन) ACSF में उत्पन्न कर रहे हैं. (सी) VNO स्लाइस एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope के तहत चयनित किया जा सकता है क्रम में करने के लिए एक विशिष्ट कल्पनाटैग संवेदी न्यूरॉन्स की आबादी. (लोमो) Tissular अखंडता acetylated - ट्यूबिलिन प्रोटीन, एक उच्च V1rb2 जीन लक्षित न्यूरॉन्स तैयारी का सही संरक्षण का प्रदर्शन की शक्ति को देखने के खिलाफ immunohistostainings द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. अपने लंबे dendrites लुमेन (ई) के रूप में अच्छी तरह के रूप में वृक्ष के समान knobs और microvilli में संरचनात्मक प्रोटीन की अभिव्यक्ति की सतह तक पहुँचने के साथ न्यूरॉन्स (एफ) मनाया जा सकता है. स्केल सलाखों हैं: बी, 5 मिमी, सी, 60 सुक्ष्ममापी, डी, 40 सुक्ष्ममापी, एफई, 20 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 3
चित्रा कैल्शियम 3. इमेजिंग और vomeronasal तीव्र ऊतक स्लाइस में फेरोमोन का पता लगाने. (ए) एक Fura 02:00 लोडिंग चरण के बाद, VNO स्लाइस एक छिड़काव कक्ष में रखा हैं और एक अनुकूलित लंगर (उच्च शक्ति दृश्य) के साथ बनाए रखा. (बी) प्रयोगों अंधेरे और VNO स्लाइस में प्रदर्शन कर रहे हैं लगातार आरटी पर ACSF के साथ एक निर्वात प्रणाली के साथ perfused. तापमान चॉस किया जा सकता हैद्विध्रुवी Pelletier तत्व और एक थर्मल जांच के द्वारा रचित एक तापमान नियंत्रक प्रणाली का उपयोग एन. यह विशेष रूप से प्रयोग आरटी पर प्रदर्शन किया गया था. (CE) VNO स्लाइस हॉफमैन चरण (सी, HV) या इसके विपरीत पहले Fura 380 एनएम रोशनी के तहत (डी) और neuronal सक्रियण (ई, यहाँ एटीपी के साथ) के दौरान नमूदार हैं. (एफ) Neuronal व्यवहार्यता एटीपी (125 सुक्ष्ममापी) के छिड़काव के साथ मूल्यांकन किया है. यहाँ, chemostimulation मूत्र (मूत्र, 1:100) के साथ या 165 मिलीलीटर / एच. के एक निरंतर प्रवाह दर पर माउस pheromones के एक मिश्रण (मिश्रण पीएच., 10 -6 एम) के साथ किया जाता है Intracellular कैल्शियम का स्तर (ΔF) प्रत्येक कक्ष के लिए व्यक्तिगत रूप से दर्ज कर सकते हैं (1 से 3 प्रकोष्ठ). (G) एक V1Rb2 न्यूरॉन GFP रोशनी (1) के तहत कल्पना है. (एच) (1) न्यूरॉन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक गैर V1rb2 व्यक्त न्यूरॉन (2) के लोड हो रहा है दिखाया गया है. (मैं) V1rb2 न्यूरॉन एक intracellular कैल्शियम की वृद्धि के साथ heptanone 2 - जवाब करने में सक्षम है. यह विशेष रूप से गैर V1rb2 व्यक्त न्यूरॉन भी 2 heptanone (सेल 2) का जवाब है. स्केल सलाखों के हैं: CE, 20 सुक्ष्ममापी, GH,15 सुक्ष्ममापी, ΔF = 340 / 380 एनएम एनएम. (एफ और मैं) उत्तेजना आवेदन की अवधि प्रत्येक का पता लगाने के तहत सलाखों से संकेत दिया है. मनमाने ढंग से रंग पैमाने प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है.

Discussion

कैल्शियम इमेजिंग विधि यहाँ प्रस्तुत करने के लिए एक गंभीर टुकड़ा तैयारी में रिकॉर्ड, माउस VNO न्यूरॉन्स की pheromonal प्रतिक्रिया करने के लिए सक्षम बनाता है. इस दृष्टिकोण के साथ, जानवर से vomeronasal न्यूरॉन्स को विच्छेदन कुछ अभ्यास के साथ है, आसानी से प्राप्त है और लंबे समय से रहने वाले एक ऊतक तैयारी प्रदान करता है. यह औषधीय जांच या pheromonal कोडिंग के अध्ययन की तरह समय लेने वाली प्रयोगों की अनुमति देता है. इस शारीरिक तकनीक के साथ, बड़ी आबादी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सटीक neuronal subpopulations विशेष रूप से विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अलावा, इस विधि को आसानी से immunohistochemical दृष्टिकोण या अन्य कैल्शियम रंगों पर आधारित प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इन संयुक्त तरीके का उपयोग निश्चित रूप से कई अनाथ माउस vomeronasal अंग में व्यक्त chemoreceptors के लिए नए pheromonal ligands की पहचान की अनुमति देगा.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम उनकी वैज्ञानिक सलाह और इमेजिंग सीआईएफ मंच खुर्दबीन उपकरणों के लिए UNIL के लिए विशेष रूप से उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Monique Nenniger Tosato के रूप में अच्छी तरह के रूप में जीन Yves Chatton शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. अनुदान स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा प्रदान की गई थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) Sigma-Aldrich A6559-25UMO
Agar Sigma-Aldrich A7002-100G Preferentially for immunohistochemistry
Agar (low-melting) Sigma-Aldrich A0701-25G Preferentially for calcium imaging
CL-100 Bipolar Temperature Controller Warner Instruments W64-0352
Confocal Microscope Leica Microsystems SP5 AOBS
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-175-071 Protect from light
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Merck & Co., Inc. 317275-100ML
Embedding molds, Peel-A-Way Polysciences, Inc. 18646A-1 22 x 22 x 20 mm
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) Rectolab H-1200
FURA-2AM Teflabs 0103 Protect from light
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) Borer Chemie Glisseal N
Large bath recording chamber (RC-26G) Warner Instruments 64-0235
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) Visitron Systems
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody Sigma-Aldrich T6793-.2ML
Normal goat serum (NGS, 10 ml) Interchim UP379030
Platform for chambers (P-1) Warner Instruments 64-0277
Pluronic F-127, 2 g Invitrogen P-6867
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) Carl Roth GmbH 0258.1
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler Warner Instruments W64-0353
Slice anchor (SHD-26GKIT) Warner Instruments 64-0266
Stereofluorescence microscope Leica Microsystems MZ16FA
Super PAP PEN (hydrophobic pen) Pelco International 22309
Triton X-100 Fluka 93420-250ML
Vibrating blade microtome VT 1200S Leica Microsystems 14048142066
VisiChrome high speed polychromator system Visitron Systems
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) Bitplane Scientific Software

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References

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Brechbühl, J., Luyet, G.,… More

Brechbühl, J., Luyet, G., Moine, F., Rodriguez, I., Broillet, M. C. Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation. J. Vis. Exp. (58), e3311, doi:10.3791/3311 (2011).

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