在小鼠体内,能够检测信息素主要介导犁鼻器(VNO)。在这里,描述一种急性组织VNO切片进行钙成像的准备。这种生理方法允许生活在一个组织中的亚群和/或单个神经元的观察和受体 – 配体识别的方便。
彼得Karlson和马丁Lüscher的使用,在1959年1的长期性信息素,首次描述用于种内通讯的化学品。信息素是易失性或非易失性的短命分子2分泌和/或在生物体液,如尿液,已知是信息素的主要来源的液体3,4中。在一个关键的动物模式,如亲属关系5,6, 分层组织 3和7,8性互动的各种信息素通讯牵连,因此直接与特定物种的生存9,10,11相关。在小鼠实验中,能够检测信息素主要介导犁鼻器(VNO)10,12,位于鼻腔的基础配对结构,并在软骨胶囊内。每个VNO有一个管腔13,14允许与外界接触的管状化学世界。感觉神经上皮主要由犁鼻器双极性感觉神经元(VSNS)15。每个VSN的一个单一的枝蔓在一个大的树突状旋钮轴承化学检测16牵连的100微绒毛向管腔结束。 VSNS许多亚群存在。他们表达,从而可能他们认识到17,18的配体(S)的化学感受器,它们是有区别的。两大犁鼻器受体的家庭,V1Rs和V2Rs 19,20,21,22,240 23 120 24名成员组成,分别在单独的层的神经上皮表达。嗅觉受体(ORS)25和甲酰肽受体(FPRs)26,27也表示VSNS。
无论这些神经元亚群,利用遥感信息素相同的下游信号通路是未知的。尽管起到透水钙通道(主要作用TRPC2)在28 TRPC2独立的传导渠道,成熟的神经元的微绒毛已建议 6,29 。由于神经元亚群的数量和特有的器官形态,在VNO目前的信号元素的药理和生理调查是复杂的。
在这里,我们目前的鼠标VNO急性组织切片进行钙成像调查的准备。这种生理方法允许意见,在活组织的天然环境,以前加载FURA – 2AM,钙染料的VSNS一般或个别亚群。这种方法也方便GFP标记的信息素受体的研究,是适应使用其他荧光钙探针。作为一个例子,我们在这里使用一个VG鼠标30行,在这种信息素V1rb2受体的翻译与一个多顺反子策略,以GFP表达。 </p>
这里介绍的钙成像方法,使记录,在急性切片制备,小鼠犁鼻器神经元的信息素反应。通过这种方法,从动物解剖的犁鼻器神经元,一些做法,很容易实现,并提供了一个长期生活的组织准备。它允许像药理调查或研究的信息素编码耗时的实验。这种生理的技术,庞大的人口数量以及精确的神经元亚群可以具体分析。此外,这种方法可以很容易地适应其他钙染料为基础的免疫组织化学方法或实验。使用相结合的方法,必将使许多孤儿在小鼠犁鼻器官中表达的化学感受器的新的信息素配体的识别。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢他的科学意见和成像CIF显微镜设备UNIL平台特别是莫尼克Nenniger Tosato她出色的技术支持,以及让 – 伊夫Chatton。由瑞士国家科学基金会提供资助。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck | 317275-100ML | |
Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth | 0258.1 | |
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |